The Effects of PPARβ/δ Ligands on Lung Inflammation and Vascular Reactivity

The peroxisome proliferator activated receptor beta/delta (PPARβ/δ) is a transcription factor ubiquitously expressed in cells, although more highly active in skeletal muscle, arteries and endothelium. Signalling via PPARβ/δ is involved in lipid metabolism, glucose metabolism, insulin sensitivity, inflammation, and cell proliferation and therefore it is emerging as a therapeutic target for the treatment of disorders associated with metabolic syndrome or diabetes. However, there are great discrepancies in the literature about the role of PPARβ/δ and scientists describe both anti- and pro-effects on inflammation, cell migration and cell proliferation after ligand-activation of PPARβ/δ. Understanding the PPARβ/δ mode of action is of great interest and may provide new molecular mechanisms for treating a variety of inflammation-related diseases. This thesis aims to expand the knowledge on PPARβ/δ to better understand its mechanism of action at genomic and non-genomic level, which might give some clues for new therapeutic drug developments targeting PPARβ/δ. Methods: Pharmacological techniques including organ bath and myography were used for the study of the non-genomic effects of PPARβ/δ on vascular tone, comparing aorta and mesenteric arteries as a model of systemic and resistance vasculature respectively from healthy and streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Molecular biology techniques including Griess assay, ELISA and qRT-PCR were used for the study of the regulation of lung inflammation by PPARβ/δ, focusing on the PPARβ/δ molecular switch between induction and trans-repression, two different pathways of gene regulation. Computational methods such as docking were used for the study of the PPARβ/δ binding pocket and how PPARβ/δ is activated/repressed after ligand binding as well as the possibility of accommodating more than one ligand simultaneously into the binding pocket. Results: In large STZ-diabetic systemic aorta arteries, PPARβ/δ inhibits the contraction through the PI3K/Akt/eNOS pathway. GW0742, a PPARβ/δ agonist, improves vasodilation through the RhoA/ROCK pathway in Naïve aorta and through potassium channels in STZ-diabetic aorta. In resistance arteries such as mesenteric arteries, PPARβ/δ inhibits the contraction through the PI3K/Akt/eNOS pathway in Naïve and possibly STZ-diabetic tissues. In contrast, GW0742 inhibits the RhoA/ROCK pathway on STZ-diabetic mesentery arteries and regulates the potassium channels in Naïve mesenteric arteries in a PPARβ/δ independent manner. In the model of lung inflammation used, the presence of agonist (GW0742 or L-165041) and antagonist (GSK3787 or GSK0660) at same time has anti-inflammatory effects and switches the PPARβ/δ mode of action from induction to trans-repression, therefore it was concluded that, at least in this model, the PPARβ/δ induction mode of action is pro-inflammatory and the trans-repression anti-inflammatory. PPARβ/δ agonists and antagonists bind differently to the PPARβ/δ receptor pocket. PPARβ/δ agonists form polar interactions with the residues His287, His413 and Tyr437 whilst PPARβ/δ antagonists form polar interactions with the residues Thr252 and Asn307. Further, our modelling indicates favourable binding energies and the feasibility of two ligands binding at same time into the PPARβ/δ binding pocket. Conclusion: A multidisciplinary approach was designed for the study of PPARβ/δ and provided novel information about its functioning both at genomic and non-genomic level. The findings of this thesis can help the drug discovery industry for a better prediction of the modelling behaviour of new PPARβ/δ drugs and can support the rationale for developing new treatments targeting PPARβ/δ for hypertension and/or cardiovascular complications

Context-dependent regulation of endothelial cell metabolism: differential effects of the PPARβ/δ agonist GW0742 and VEGF-A

Peroxisome proliferator activated receptor β/δ (PPARβ/δ) has pro-angiogenic functions, but whether PPARβ/δ modulates endothelial cell metabolism to support the dynamic phenotype remains to be established. This study characterised the metabolic response of HUVEC to the PPARβ/δ agonist, GW0742, and compared these effects with those induced by VEGF-A. In HUVEC monolayers, flux analysis revealed that VEGF-A promoted glycolysis at the expense of fatty acid oxidation (FAO), whereas GW0742 reduced both glycolysis and FAO. Only VEGF-A stimulated HUVEC migration and proliferation whereas both GW0742 and VEGF-A promoted tubulogenesis. Studies using inhibitors of PPARβ/δ or sirtuin-1 showed that the tubulogenic effect of GW0742, but not VEGF-A, was PPARβ/δ- and sirtuin-1-dependent. HUVEC were reliant on glycolysis and FAO, and inhibition of either pathway disrupted cell growth and proliferation. VEGF-A was a potent inducer of glycolysis in tubulogenic HUVEC, while FAO was maintained. In contrast, GW0742-induced tubulogenesis was associated with enhanced FAO and a modest increase in glycolysis. These novel data reveal a context-dependent regulation of endothelial metabolism by GW0742, where metabolic activity is reduced in monolayers but enhanced during tubulogenesis. These findings expand our understanding of PPARβ/δ in the endothelium and support the targeting of PPARβ/δ in regulating EC behaviour and boosting tissue maintenance and repair

The mechanistic basis of prostacyclin and its stable analogues in pulmonary arterial hypertension: Role of membrane versus nuclear receptors

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease of distal pulmonary arteries in which patients suffer from elevated pulmonary arterial pressure, extensive vascular remodelling and right ventricular failure. To date prostacyclin (PGI2) therapy remains the most efficacious treatment for PAH and is the only approved monotherapy to have a positive impact on long-term survival. A key thing to note is that improvement exceeds that predicted from vasodilator testing strongly suggesting that additional mechanisms contribute to the therapeutic benefit of prostacyclins in PAH. Given these agents have potent antiproliferative, anti-inflammatory and endothelial regenerating properties suggests therapeutic benefit might result from a slowing, stabilization or even some reversal of vascular remodelling in vivo. This review discusses evidence that the pharmacology of each prostacyclin (IP) receptor agonist so far developed is distinct, with non-IP receptor targets clearly contributing to the therapeutic and side effect profile of PGI2 (EP3), iloprost (EP1), treprostinil (EP2, DP1) along with a family of nuclear receptors known as peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), to which PGI2 and some analogues directly bind. These targets are functionally expressed to varying degrees in arteries, veins, platelets, fibroblasts and inflammatory cells and are likely to be involved in the biological actions of prostacylins. Recently, a highly selective IP agonist, selexipag has been developed for PAH. This agent should prove useful in distinguishing IP from other prostanoid receptors or PPAR binding effects in human tissue. It remains to be determined whether selectivity for the IP receptor gives rise to a superior or inferior clinical benefit in PAH

Peroxisome Proliferator-Activated Receptors and Caloric Restriction-Common Pathways Affecting Metabolism, Health, and Longevity.

Caloric restriction (CR) is a traditional but scientifically verified approach to promoting health and increasing lifespan. CR exerts its effects through multiple molecular pathways that trigger major metabolic adaptations. It influences key nutrient and energy-sensing pathways including mammalian target of rapamycin, Sirtuin 1, AMP-activated protein kinase, and insulin signaling, ultimately resulting in reductions in basic metabolic rate, inflammation, and oxidative stress, as well as increased autophagy and mitochondrial efficiency. CR shares multiple overlapping pathways with peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), particularly in energy metabolism and inflammation. Consequently, several lines of evidence suggest that PPARs might be indispensable for beneficial outcomes related to CR. In this review, we present the available evidence for the interconnection between CR and PPARs, highlighting their shared pathways and analyzing their interaction. We also discuss the possible contributions of PPARs to the effects of CR on whole organism outcomes

The Role of PPARs in Disease

This reprint combines recent original manuscripts and reviews covering the multiple functions of peroxisome proliferator-activated receptors in physiology and pathophysiology. Potential applications and limitations of PPAR agonists and antagonists are discussed. All original contributions were published in Cells

PPARs as Key Mediators of Metabolic and Inflammatory Regulation

Mounting evidence suggests a bidirectional relationship between metabolism and inflammation. Molecular crosstalk between these processes occurs at different levels with the participation of nuclear receptors, including peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs). There are three PPAR isotypes, α, β/δ, and γ, which modulate metabolic and inflammatory pathways, making them key for the control of cellular, organ, and systemic processes. PPAR activity is governed by fatty acids and fatty acid derivatives, and by drugs used in clinics (glitazones and fibrates). The study of PPAR action, also modulated by post-translational modifications, has enabled extraordinary advances in the understanding of the multifaceted roles of these receptors in metabolism, energy homeostasis, and inflammation both in health and disease. This Special Issue of IJMS includes a broad range of basic and translational article, both original research and reviews, focused on the latest developments in the regulation of metabolic and/or inflammatory processes by PPARs in all organs and the microbiomes of different vertebrate species

Dyslipidemia

Dyslipidemia has a complex pathophysiology consisting of various genetic, lifestyle, and environmental factors. It has many adverse health impacts, notably in the development of chronic non-communicable diseases. Significant ethnic differences exist due to the prevalence and types of lipid disorders. While elevated serum total- and LDL-cholesterol are the main concern in Western populations, in other countries hypertriglyceridemia and low HDL-cholesterol are more prevalent. The latter types of lipid disorders are considered as components of the metabolic syndrome. The escalating trend of obesity, as well as changes in lifestyle and environmental factors will make dyslipidemia a global medical and public health threat, not only for adults but for the pediatric age group as well. Several experimental and clinical studies are still being conducted regarding the underlying mechanisms and treatment of dyslipidemia. The current book is providing a general overview of dyslipidemia from diverse aspects of pathophysiology, ethnic differences, prevention, health hazards, and treatment

Effect of RXR/PPAR interaction in angiotensin II-induced vascular inflammation and angiogenesis. Role of CXCL16/CXCR6 axis in angiotensin II or cigarette smoke-induced vascular inflammation

Aumentos en los niveles circulantes de mediadores, incluyendo angiotensina II (Ang-II) y citoquinas, han sido detectados en enfermedades cardiovasculares y cardiometabólicas como la hipertensión, la obesidad y la diabetes, y parecen ejercer efectos negativos sobre la función endotelial (Granger et al., 2004; Marinou et al., 2010). Estos agentes inician una cascada inflamatoria de señalización que promueve la generación de especies reactivas del oxígeno, aumento en la superficie celular de la expresión de moléculas de adhesión y mayor adhesividad de leucocitos a las células endoteliales (Libby, 2002; Granger et al., 2004). Estas respuestas están asociadas con la disfunción endotelial, un estado pro-trombótico y pro-inflamatoria del endotelio (Landmesser et al., 2004) que juega un papel importante a las primeras etapas de la aterogénesis (Libby, 2002; Landmesser et al., 2004; Galkina et al., 2009). Rosuvastatina (Rosu) y Bexaroteno (Bex) son fármacos comúnmente prescritos para tratar la hipercolesterolemia y el linfoma de células T, respectivamente, que además han demostrado inhibir la inflamación vascular (Mira et al., 2009; Farol et al., 2004; Sanz et al., 2012) y que, a pesar de su actividad antiinflamatoria, producen graves efectos adversos relacionados con dosis. Aunque generalmente bien toleradas, las estatinas se asocian con miopatías y fallo renal agudo (Golomb et al., 2008; Hoffman et al., 2012; Dormuth et al., 2013). Así mismo, el tratamiento con Bex se asocia con efectos secundarios inevitables y que limitan la dosis administrada, en particular, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y en menor medida hipotiroidismo (de Vries-van der Weij et al., 2009; Vakeva et al., 2012). Sin embargo, la administración de Rosu reduce los niveles de triglicéridos (Florentin et al., 2013), por ello en las guías clínicas sobre la prescripción segura de Bex se recomienda el uso conjunto con estatinas con el fin de prevenir los efectos dislipémicos (Scarisbrick et al., 2013). Por consiguiente, debido a la necesidad de estrategias más eficaces y seguras para prevenir y tratar la aterosclerosis, en la presente tesis evaluamos el efecto de la coadministración de Rosu y Bex en la inflamación vascular causada por Ang-II. Para ello, células endoteliales de arteria de cordón umbilical humano (HUAEC) fueron tratadas con vehículo, Rosu (10-30 nM), Bexa (0,3-1 μM) o una combinación de ambos, 20 h antes de la estimulación con Ang-II 1 μM durante 4h. Sorprendentemente, la combinación de Rosu (10 nM) + Bex (0,3 μM), que no ejercieron efecto sobre el reclutamiento de células mononucleares inducido por Ang-II cuando ambos fármacos fueron estudiados por separado, significativamente redujo esta respuesta. Este efecto fue acompañado por una disminución de la expresión en el endotelio de ICAM-1, VCAM-1 y CX3CL1 así como de la producción de CXCL1, CXCL8, CCL2 y CCL5 inducida por Ang II. La preincubación de HUAECs con Rosu y Bex inhibió la expresión Nox5 y la consecuente activación de RhoA inducida por Ang-II a través de una mayor expresión RXRα, PPARα y PPAR, además del aumento de las interacciones RXRα/PPARα y RXRα/PPAR. In vivo, la combinación, pero no la administración por separado, de Rosu (1,25 mg/kg/día) y Bex (10 mg/kg/día), disminuyó significativamente la adhesión de leucocitos a la microcirculación cremastérica arteriolar causada por Ang-II en ratones C57BL/6 y la formación de la lesión aterosclerótica en ratones deficientes en la apolipoproteína E (apoE-/-) sometidos a una dieta aterogénica. Por todo lo anteriormente expuesto podemos concluir que la administración conjunta de Rosu y Bex a dosis subóptimas podría constituir una nueva y eficaz alternativa de tratamiento en el control de la inflamación vascular asociada a desordenes cardiometabólicos debido a que la sinergia en su actividad antiinflamatoria podría contrarrestar sus reacciones adversas. El aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una importante causa de muerte en los países desarrollados. A pesar de ello, existe un gran desconocimiento de los mecanismos responsables de la iniciación, propagación y ruptura del AAA. Los estudios realizados demuestran que el sistema renina angiotensina y la angiogénesis juegan un papel fundamental en el desarrollo de esta patología. De hecho, la formación de nuevos microvasos está relacionada con el riesgo de ruptura y las complicaciones que causan la alta tasa de mortalidad asociada a este estado patológico. El Bex es un fármaco agonista del Receptor del Retinoide X (RXR) con actividad antiangiogénica. Dicho receptor forma heterodímeros permisivos con los Receptores Activadores de la Proliferación Peroxisomal (PPAR). A su vez, las estatinas son capaces de activar los receptores PPAR. Dado que nuevos estudios indican que un solo fármaco antiangiogénico puede no ser suficiente para combatir la amplia gama de factores angiogénicos producidos y las vías implicadas en el proceso angiogénico, es importante encontrar nuevos enfoques farmacológicos para detener su la formación y progresión de la lesión. Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se investigó el efecto del tratamiento combinado de Rosu y Bex en el AAA inducido por Ang-II así como el proceso angiogénico y los mecanismos subyacentes implicados. Para ello, se administraron durante 28 días ambos fármacos, en un modelo animal de AAA en ratones apoE-/- inducido por Ang-II y dieta grasa. El tratamiento combinado de Rosu y Bex a dosis de 10 mg/kg/día redujo significativamente la incidencia de AAA. Además, dicha terapia combinada disminuyó la neovascularización, la infiltración de macrófagos y los niveles de expresión de ARNm de las quimiocinas KC/CXCL1, MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 y el factor de crecimiento vascular, VEGF, disminución que parece estar mediada por la activación de las interacciones RXRα/PPARα y RXRα/PPARγ. Estas respuestas fueron acompañadas de una menor activación de la ruta de señalización AKT/mTOR/p70S6K1. En conjunto, estos resultados sugieren que la combinación a dosis subóptimas de un agonista de RXR y una estatina interfiere sinérgicamente con los mecanismos de señalización que modulan la angiogénesis, así como la inflamación asociada a la misma, pudiendo constituir una nueva herramienta terapéutica para la prevención del desarrollo del AAA. CXCL16 es una quimiocina transmembrana que, debido a su doble función como sustancia quimioatrayente y molécula de adhesión de monocitos y linfocitos, así como su presencia en la pared vascular, hace que sea un candidato atractivo para jugar un papel fundamental en el proceso inflamatorio vascular. Sin embargo, hasta la fecha su papel en AAA y la inflamación vascular inducida por Ang- II no ha sido caracterizado. Por lo tanto, en la presente tesis doctoral se ha investigado la potencial implicación del eje CXCR6/CXCL16 en la inflamación vascular inducida por Ang-II así como los mecanismos relacionados en este proceso. Mediante estudios in vivo, observamos que el tratamiento con Ang-II durante 15 días produjo un aumento en la expresión de CXCL16 en las arteriolas cremastericas del ratón que se correlacionó con un aumento en la adhesión de los leucocitos al endotelio arteriolar. A continuación nos planteamos trasladar estas observaciones a un modelo patológico. Por ello, evaluamos el efecto de un antagonista del receptor AT1 de Ang-II, losartán, y la posible implicación de CXCL16, en un modelo experimental de AAA. Ratones deficientes en apo E -/- fueron sometidos a una dieta rica en grasa y estimulados durante 28 días con Ang-II (500 ng/kg/min). Algunos animales fueron tratados con losartán a dos dosis: 10 y 30 mg/kg/día. Los animales no tratados pero sí estimulados con Ang-II mostraron mayor incidencia de AAA, incremento de la infiltración de macrófagos, linfocitos CD3+, células CXCR6+ y neovascularización. Estos efectos fueron acompañados de un incremento en la lesión de la expresión de ARNm de MCP-1/CCL2, CXCL16, CXCR6 y del factor de crecimiento vascular VEGF. Losartán a una dosis de 30 mg/kg/día, logró reducir todos estos eventos. Mediante estudios in vitro se detectó un aumento en la expresión de CXCL16 cuando las HUAECs fueron estimuladas con Ang-II 1 μM, la neutralización de su actividad inhibió significativamente la interacción de leucocitos mononucleares a HUAEC inducida por Ang-II. El aumento de la expresión de CXCL16 inducida por Ang-II fue dependiente de la expresión de Nox5, la generación de radicales libres y la subsiguiente activación de RhoA/p38-MAPK/NFκB. Estos resultados sugieren que el eje CXCL16/CXCR6 podría constituir una nueva estrategia terapéutica en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares asociadas a la activación del sistema renina-angiotensina. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria crónica del tracto respiratorio muy compleja, que involucra diferentes tipos de células inflamatorias y estructurales, las cuales a su vez tienen la capacidad de liberar múltiples mediadores inflamatorios locales y sistémicos. La enfermedad es una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones, principalmente al humo del cigarro (también gases y partículas nocivas) que conduce a una disminución lenta, progresiva e irreversible de la ventilación pulmonar. Las enfermedades cardiovasculares son unas de las comorbilidades más frecuentemente asociadas a la EPOC, aunque los mecanismos implicados en su desarrollo son aún desconocidos. En este estudio hemos investigado la posible relación entre el eje CXCR6/CXCL16 y la disfunción endotelial asociada a la EPOC. La citometría de flujo se utilizó para comparar la expresión de marcadores activación plaquetaria, expresión de CXCL16/CXCR6 en plaquetas y la expresión de CXCR6 en leucocitos de pacientes de EPOC versus controles sanos. Estos estudios revelaron que los pacientes de EPOC presentan mayor número de plaquetas activadas (PAC-1+) con mayor expresión de P-selectina, CXCL16 y CXCR6 además de un incremento en la adhesión leucocito-plaqueta comparado con los controles. Estos pacientes también presentaron mayor expresión de CXCR6 en leucocitos mononucleares. Basándonos en estos resultados procedimos a ampliar el estudio trasladando los resultados obtenidos a estudios in vitro en células humanas. En primer lugar, en condiciones fisiológicas de flujo, se observó que los leucocitos mononucleares procedentes de pacientes de EPOC presentaban mayor adhesividad al endotelio arterial estimulado con humo de tabaco. A continuación, se observó que la estimulación con extracto de humo de tabaco (EHT) promueve un aumento en la expresión arterial de CXCL16 tanto a nivel de ARNm y como de proteína en HUAECs. En condiciones fisiológicas de flujo, CXCL16 medió la adhesión de leucocitos mononucleares al endotelio arteriolar estimulado con EHT, dicho aumento en la adhesión fue significativamente inhibido mediante el bloqueo de la actividad de CXCL16. El aumento de la expresión de CXCL16 inducida por EHT fue dependiente de la expresión de Nox5 y la subsiguiente activación de la vía RhoA/p38-MAPK/NFκB. Mediante microscopia intravital, el reclutamiento leucocitario en animales expuestos a HT durante 3 días fue evaluado. Nuestros resultados indican que el humo de tabaco produjo inflamación pulmonar y además incrementó las interacciones leucocito-endotelio en el cremaster de ratón, poniendo de manifiesto una mayor inflamación sistémica. Cabe destacar que estas respuestas fueron significativamente reducidas en ratones deficientes en el receptor de CXCL16 (CXCR6). En este estudio se presentan las primeras evidencia de aumento de expresión de CXCR6 en plaquetas y leucocitos circulantes con pacientes de EPOC, lo que puede constituir un nuevo marcador pronóstico de enfermedades cardiovasculares asociadas a esta patología. Además el bloqueo del eje CXCL16/CXCR6 podría constituir una nueva diana terapéutica en la prevención y tratamiento de las enfermedades cardiovasculares asociadas a la EPOC

Vasodilatadores en la hipertensión pulmonar: selectividad por el territorio vascular, por oxígeno y efectos antiproliferativos

La Hipertensión Pulmonar (HP) es una enfermedad crónica y progresiva. La HP presenta una compleja fisiopatología caracterizada por vasoconstricción, remodelado vascular y trombosis. Las terapias actuales muestran efectos beneficiosos, sin embargo presentan también importantes limitaciones: 1) pobre selectividad pulmonar, 2) modesta eficacia vasodilatadora, 3) desacoplamiento de la ventilación/perfusión (V/Q) e 4) incapacidad para prevenir la progresión de la enfermedad. La quercetina es un flavonoide natural que se consume en la dieta. Ejerce efectos in vitro como vasodilatador, antiagregante y antiproliferativo. Además, reduce la presión arterial, la hipertrofia cardíaca y el remodelado vascular en modelos animales de hipertensión arterial. Hipótesis y objetivos La hipótesis general de esta tesis es que los fármacos vasodilatadores sensibles al oxígeno con selectividad pulmonar son eficaces para reducir la presión arterial pulmonar (PAP) y para preservar o mejorar la oxigenación arterial. El objetivo general de esta tesis es analizar los efectos vasodilatadores y antiproliferativos de una amplia gama de fármacos con el fin de identificar aquellos que potencialmente presenten una mejor eficacia y menos efectos secundarios, basado en su capacidad para: 1) combinar los efectos como vasodilatador y antiproliferativo, 2) ejercer efectos vasodilatadores selectivos en la circulación pulmonar, evitando la hipotensión sistémica, 3) inducir vasodilatación selectiva en zonas bien oxigenadas (preservando la vasoconstricción pulmonar hipóxica‐VPH) y 4) ejercer vasodilatación eficaz en condiciones de sensibilización al calcio. Material y métodos La selectividad pulmonar y por oxígeno se evaluaron utilizando arterias mesentérica y pulmonares (AP) de ratas y AP humanas bajo diferentes condiciones de oxigenación en un miógrafo isométrico. Las preparaciones se estimularon con una mezcla de serotonina, U46619 y endotelina‐1 antes de realizar curvas concentración‐respuesta a diferentes fármacos..