Variable optical elements for fast focus control

In this Review, we survey recent developments in the emerging field of high-speed variable-z-focus optical elements, which are driving important innovations in advanced imaging and materials processing applications. Three-dimensional biomedical imaging, high-throughput industrial inspection, advanced spectroscopies, and other optical characterization and materials modification methods have made great strides forward in recent years due to precise and rapid axial control of light. Three state-of-the-art key optical technologies that enable fast z-focus modulation are reviewed, along with a discussion of the implications of the new developments in variable optical elements and their impact on technologically relevant applications

Flow Assessment Using Optical Coherence Microscopy Based Particle Image Velocimetry

Congenital heart diseases (CHDs) are the most common forms of congenital malformation in newborns. Among all types of CHDs, a large portion is contributed by malformation of endocardial cushion malformation during early heart development. Although the etiology of endocardial cushion malformation is unclear, it is a result of interactions between genetic and environmental factors has been confirmed. There is hypothesis indicating that malformation of endocardial cushion is caused by altered shear stress conditions where in cushion forming area the shear stress is supposed to be high compare with other area in congenital heart. However it is difficult to justify due to lack of in vivo imaging modality that is able to monitor structure and hemodynamic conditions simultaneously and over long time period. To address this problem, we present an optical coherence microscopy based particle image velocimetry system. This system is capable of invasively imaging biological sample structures at micrometer resolution and providing velocity information at the same time. With this imaging set up we successfully assessed velocity profile in a microfluidic system with simultaneous structure details demonstration of the microfluidic channel. Both flow measurement and structural information were verified using conventional microscopy. As a result, OCM-based PIV imaging modality not only makes it feasible to study in detail the process of congenital heart remodeling in response to environmental alterations, but also provides new options for measuring fluid flow in live tissue

Acousto-optic systems for advanced microscopy

Acoustic waves in an optical medium cause rapid periodic changes in the refraction index, leading to diffraction effects. Such acoustically controlled diffraction can be used to modulate, deflect, and focus light at microsecond timescales, paving the way for advanced optical microscopy designs that feature unprecedented spatiotemporal resolution. In this article, we review the operational principles, optical properties, and recent applications of acousto-optic (AO) systems for advanced microscopy, including random-access scanning, ultrafast confocal and multiphoton imaging, and fast inertia-free light-sheet microscopy. As AO technology is reaching maturity, designing new microscope architectures that utilize AO elements is more attractive than ever, providing new exciting opportunities in fields as impactful as optical metrology, neuroscience, embryogenesis, and high-content screening

CA1-projecting subiculum neurons facilitate object-place learning.

Recent anatomical evidence suggests a functionally significant back-projection pathway from the subiculum to the CA1. Here we show that the afferent circuitry of CA1-projecting subicular neurons is biased by inputs from CA1 inhibitory neurons and the visual cortex, but lacks input from the entorhinal cortex. Efferents of the CA1-projecting subiculum neurons also target the perirhinal cortex, an area strongly implicated in object-place learning. We identify a critical role for CA1-projecting subicular neurons in object-location learning and memory, and show that this projection modulates place-specific activity of CA1 neurons and their responses to displaced objects. Together, these experiments reveal a novel pathway by which cortical inputs, particularly those from the visual cortex, reach the hippocampal output region CA1. Our findings also implicate this circuitry in the formation of complex spatial representations and learning of object-place associations

Data-driven microscopy: placing high-fidelity data in a population-wide context

Mikroskopi är idag ett fundamentalt verktyg inom forskning, där det tillåter oss att skåda in och utforska våra prover i hög detalj. Mycket utav utvecklingen av nya mikroskopimetoder har strävat efter att öka den detaljnivå vi kan uppnå. Samtidigt har utvecklingen inom hårdvara, med tillgång till bättre och mer kraftfulla instrument, lett till utveckligen av metoder där fokuset är att studera en hel population av celler. Till skillnad från när vi studerar ett fåtal celler i hög detalj, tillåter det oss att sätta perspektiv på det vi ser. Det ger oss en förmåga att säga vad det normala beteendet som man kan förvänta sig är, och vilka celler som sticker ut i en population. Med andra ord, vad som är intressant.Samtidigt finns det ett stort intresse av att veta hur varje individuell cell beter sig. Varje cell är, precis som oss människor, unik. De har olika historia, olika ålder och befinner sig i olika tillstånd. Precis som våra celler i kroppen är unika, är även de cellerna som kan orsaka sjukdom unika. För att förstå varför vissa personer är mer känsliga mot sjukdom, och hur en infektion svarar på våra behandlingar behövs en förståelse och an förmåga att studera celler på individuell nivå, samtidigt som vi bibehåller ett perspektiv utifrån populations-nivå.Denna brist på perspektiv har länge varit ett problem inom mikroskopi. Den vanliga lösningen på detta problem är att vi, som människor, kan tolka en bild och peka på vad det är som är intressant eller inte. Vi är, trots allt, extremt duktiga på att tolka visuell information. Men detta är inte en helt felfri lösning. Som människor kan vi vara relativt okonsekventa, vi tolkar oftast utifrån hur vi vill att datan ser ut. Med andra ord, vi saknar förmågan att vara objektiva i vår metodik för att samla in bilder i hög detalj.Min avhandling har till stor del handlat om att utveckla ett verktyg som tillåter oss att sätta perspektiv på det vi studerar med mikroskopi. Detta har lett till Arbete 1, där vi presenterar en allmän strategi (data-styrd mikroskopi) för hur vi kan arbeta med mikroskopi för att samla in data på en hel population, samtidigt som vi kan samla in data med hög detalj på relevanta fynd i populationen. Vi presenterar även här en teknisk lösning, och utför metoden i tre olika scenarion: ett för att studera en population av celler mer allmänt, ett för att fånga det ögonblick som bakterier infekterar mänskliga celler, och ett där vi studerar och fångar in data på relevanta (från ett populations-kontext) cancerceller och följer dem över tid. Denna metod tillåter oss att samla in data i hög detalj på ett objektivt sätt, och att sätta perspektiv på det vi studerar.I Arbete 2 har vi vidare utvecklat på vår metod, där vi försöker lösa problemet att hitta en och samma cell i flera olika mikroskop. Eftersom vi, genom mikroskopi, jobbar på en så ofantligt liten skala, är det oftast väldigt svårt att orientera sig och hitta rätt inom ett prov. Det är lite som att spela På spåret och gissa vart man är, fast utan alla ledtrådar man får på varje nivå. Eftersom vi har tillgång till data på en hel population, så utgick vi från att det borde finnas samband mellan celler och deras grannar i ett prov som är unika för just dem. Genom att använda sig av dessa unika samband kom vi fram med en lösning där vi snabbt kan kalibrera ett prov på ett nytt mikroskop. Det öppnar dörrarna för oss forskare att återanvända prov, att lättare justera provet med nya markörer (för det vi vill visualisera inom cellerna), och att kunna tolka ett prov med data insamlat från flera system.COVID-19 pandemin var en stor omställning för samhället och vården. Likväl var det en stor omställning för många forskningslabb, där en kapplöpning startade för att så snabbt som möjligt förstå sig på hur viruset fungerar och hur vårt immunförsvar svarar på dess infektion. Det var i detta kontext som mitt tredje arbete utfördes. Genom den erfarenhet jag samlat på mig inom mikroskopi och att analysera bilder på stora dataset, bidrog jag med hjälp för att studera hur framtagna antikroppar kan förhindra bindningen av virus-lika partiklar till celler. Antikroppar är ett protein som immunförsvaret producerar i respons mot en patogen. En bättre förståelse kring hur antikroppar verkar, och vad skillnaden mellan en bra och en dålig antikropp är kan leda till framtagningen av bättre vaccin-program och behandlingar inom sjukvården.I Arbete 4 medverkade jag i ett arbete där bakterien Streptococcus pyogenes var i fokus. S. pyogenes enda värd är människor, och ansvarar för över 600 miljoner infektionsfall per år globalt. På bakteriens yta dominerar ett protein, M-proteinet, ett multi-funktionellt protein som bakterien (bland annat) använder sig för att binda till ytor och förhindra immunförsvarets förmåga att göra sig av med bakterien. I arbetet upptäckte vi att fibronektin binder till bakterien (specifikt M-proteinet) olika mycket beroende på mängden antikroppar som finns i miljön. Fibronektin är ett protein som vi människor producerar, och bidrar (bland annat) till att skapa den miljön som celler befinner sig i. Mängden fibronektin varierar beroende på var i kroppen man kollar. Till exempel, i saliv har du en relativt låg mängd fibronektin jämfört med i blodet. Detta ledde till hypotesen att bakterien är special-anpassad för olika miljöer i dess förmåga att undkomma immunförsvaret. En bättre förståelse kring hur bakterien är anpassad till våra olika miljöer och dess infektionsförlopp kan leda till bättre och mer anpassade behandlingar inom sjukvården

Temporal and Spatial Coherence: chronological and affective narrative within holographic and lenticular space.

The thesis for this practice-based study maintains that the Z and X axes of lenticular and holographic space can be used to store images chronologically, providing an audience with a new experience with affective and authentic impact. My contribution to knowledge has been to create a new element to the lenticular, analogue and digitally animated holographic artform. My research presents my family’s archival material – photographs, film, text and objects – in a sequential order within the Z and X axes of holographic space, creating an animated four-dimensional (4-D) family album in which my ancestors recede into holographic space and members of the current generation float in front of the surface of the media. Audience experience of the artwork has been gathered and evaluated, providing evidence of the research study’s contribution to knowledge.University of Southampto

Development of a Three-Dimensional Trap for Single-Molecule Studies with a Four-Focus Confocal Fluorescence Microscope

This dissertation presents the development of an instrument based on a confocal fluorescence microscope for feedback-driven trapping of a single molecule or nanoparticle in three-dimensions as it undergoes Brownian diffusion within an aqueous medium. Such trapping enables prolonged observation of a molecule while untethered and free from collisions with surfaces, which is needed to improve various studies, such as investigations of protein folding dynamics, molecular heterogeneities, and interactions. In the experiment, a dilute solution (~100 pM) of fluorescent nano-objects is inserted into a microfluidic device, which achieves trapping by control of electroosmotic flows in two crossed channels. The geometry, which is designed using COMSOL Multiphysics, funnels the flows to achieve sufficient electroosmotic speed to counteract Brownian diffusion while maintaining a 4:1 width-to-depth for wide-angle light collection by the microscope objective from the center of the crossing region. A fluorescence excitation volume centered at this point is defined by four overlapping focused laser beams, each with ~0.5 μm beam waist but with centers offset in a tetrahedral arrangement. The beams are derived from a mode-locked laser using a series of beam splitters with the pulses in each beam delayed to provide pulse-interleaved excitation at 304 MHz. Fluorescence is collected through a pinhole and split to two single-photon detectors, which provide signals for an FPGA (Field Programmable Gate Array) for time-gated counting into four channels synchronous with the pulses in each of the laser beams. The FPGA also bins the counts and applies an algorithm to estimate the direction of the position offset of the nano-object and to adjust four voltages. These are applied at the four fluid inlets of the microfluidic cross-channel to electroosmotically drive the fluid to keep the nano-object at the midpoint of the four foci. Movies of camera imaging of trapped nano-objects were acquired. Results show trapping of 40 nm FluoSpheres for ~4 minutes, 20 nm FluoSpheres for ~25 seconds, and 5 nm protein molecules of Streptavidin-Alexa Fluor™ 647 for ~1.5 seconds. In addition, Maximum Likelihood Estimation of positions from binned photons was conducted for the FluoSphere experiments to estimate effective spring constants of the trap

Development and applications of high speed and hyperspectral nonlinear microscopy

Nonlinear microscopy refers to a range of laser scanning microscopy techniques that are based on nonlinear optical processes such as two-photon excited fluorescence and second harmonic generation. Nonlinear microscopy techniques are powerful because they enable the visualization of highly scattering biological samples with subcellular resolution. This capability is especially valuable for in vivo and live tissue imaging since it can provide both structural and functional information about tissues in their native environment. With the use of a range of exogenous dyes and intrinsic contrast, in vivo nonlinear microscopy can be used to characterize and measure dynamic processes of tissues in their normal environment. These advances have been particularly relevant in neuroscience, where truly understanding the function of the brain requires that its neural and vascular networks be observed while undisturbed. Despite these advantages, in vivo nonlinear microscopy still faces several major challenges. First, observing dynamics that occur in large areas over short time scales, such as neuronal signaling and blood flow, is challenging because nonlinear microscopy generally requires scanning to create an image. This limits the study of dynamic behavior to either a single plane or to a small subset of regions within a volume. Second, applications that rely on the use of exogenous dyes can be limited by the need to stain tissues before imaging, the availability of dyes, and specificity that can be achieved. Usually considered a nuisance, endogenous tissue contrast from autofluorescence or structures exhibiting second harmonic generation can produce stunning images for visualizing subcellular morphology. Imaging endogenous contrast can also provide valuable information about the chemical makeup and metabolic state of the tissue. Few methods have been developed to carefully and quantitatively examine endogenous fluorescence in living tissues. In this thesis, these two challenges in nonlinear microscopy are addressed. The development of a novel hyperspectral two-photon microscopy method to acquire spectroscopic data from tissues and increase the information available from endogenous contrast is presented. This system was applied to visualize and identify sources of endogenous contrast in gastrointestinal tissues, providing robust references for the assessment of normal and diseased tissues. Secondly, three methods for high speed volumetric imaging using laser scanning nonlinear microscopy were developed to address the need for improved high-speed imaging in living tissues. A spectrally-encoded high-speed imaging method that can provide simultaneous imaging of multiple regions of the living brain in parallel is presented and used to study spontaneous changes in vascular tone in the brain. This technique is then extended for use with second harmonic generation microscopy, which has the potential to greatly increase the degree of multiplexing. Finally, a complete system design capable of volumetric scan rates >1Hz is shown, offering improved performance and versatility to image brain activity