Improved strategy for large scale isolation of sialylglycopeptide (SGP) from egg yolk powder

Chicken egg yolk is an easily available source for the isolation of sialylglycopeptides (SGP) carrying homogenous biantennary N-glycans. This approach has gained much attention in the last decade since these SGPs can easily be used for the semi-synthesis of glycoconjugates circumventing laborious full-synthetic methodologies. Here we report an optimised, significantly shorter (one day instead of five) and environmentally friendly procedure for the mg scale isolation of SGP using commercially available egg yolk powder. A single chromatographic step following chloroform/methanol precipitation of proteins and lipids yielded desired approximately 200 mg SGP from 250 g egg yolk powder within a day. •Environmentally friendly procedure for isolation of sialylglycopeptide from Egg yolk powder. •Reduced the protocol from five days down to one

Preparation of the fluorescein reagent for solid-phase oligonucleotide 5'-labelling and its use for the synthesis of fluorescently labelled PCR primers for HIV-1 detection

The preparative synthesis of fluorescein H-phosphonate reagent for solid phase 'labelling of oligonucteotides is described. Fluorescein-labelted thymidine and two PCR primers for HIV-1 detection were synthesized using this reagent.Описано препаративний метод синтезу Н-фосфонатного реагента для флюоресцентного мічення олігонуклеотидів безпосередньо в процесі їх твердофазного синтезу. За допо­могою цього реагента синтезовано флюоресцеїн-мічені тимідин та два праймери для ампліфікації дліяики гена HIV-1.Описан препаративный метод синтеза Н-фосфонатного реагента для флюоресцентного мечения олигонуклеотидов непосредственно в процессе пх твердофазного сшпеза. С помощью этого реагента синтезированы флюоресценнмеченные тимидны и два праймера для амплификации участка гена HlV-1

Синтез та вивчення антисенсових олігонуклеотидів, модифікованих імідазофеназиновими нуклеозидами

Н-фосфонатним твердофазным методом отримано модифіковані імідазофеназиновими нуклеози­дами по 3'-, 5'- та внутрішніх положеннях олігонуклеотиди, комплементарні до ділянок рибосомного оперона, 16S рРНК мікоплазм та Escherichia coli. Показано, шр нуклеозиди імідазо[4,5-b]феназину та його 2-метального аналога, діючи як ефективні інтеркалятори, суттєво впливають на стабільність комплементарних дуплексів і тим самим підвищують антисенсову активність модифікованих олігонуклеотидних послідовностей.Н-фосфонатным твердофазным методом получены модифи­цированные имидазофеназиновыми нуклеозидами по 3'-, 5'- и внутренним положениям олигонуклеотиды, комплементарные участкам рибосомного оперона, 16S рРНК микоплазм и Es­cherichia coli. Показано, что нуклеозиды имидазо[4,5-b]феназина и его 2-метильного аналога, действуя как эффективные интеркаляторы, существенно влияют на стабильность комп­лементарных дуплексов, повышая тем самым антисмысловую активность модифицированных олигонуклеотидных последова­тельностей.Oligonucleotides containing imidazophenazine nucleosides at 3'-, 5'-and internal positions, which are complementary to certain regions of ribosomal operon DNA and I6S rRNA of mycoplasmas and E. coli, have been synthesized by H-phosphonate solid phase method. It has been shown that nucleosides of imidazol [4,5-b]phenazine and its 2-methyl analog as efficient intercalating agents strongly affect the stability of complementary complexes increasing the antisense activity of modified otigonucleotide sequence

Усвоение клетками молликутов антисмысловых аналогов олигодезоксирибонуклеотидов

Исследованы процессы связывания и поглощения клетками Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 и M. pneumoniae FH тиофосфатных, дитиофосфатных и метилфосфонатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных «сигнатурным» последовательностям 16S рРНК. Обнаружены различия в эффективности связывания данными клетками тиофосфат­ных и метилфосфонатных аналогов олигонуклеотидов. Так, уровень сорбции тиофосфатов клетками A. laidlawii PG-8 превышал долю связавшихся с этими клетками метилфосфонатов более чем в 5 раз. Установлен факт значительного накопления клетками молликутов тио- и дитиофосфатных аналогов олигонуклеотидов. Внутриклеточная концентрация этих соединений у всех изученных микроорганизмов превышала внеклеточную в 104–105 раз. На основе полученных экспериментальных данных сделано предположение о существовании в клетках молликутов двух различных механизмов поглощения аналогов олигонуклеотидов, несущих отрицательный заряд в рибозофосфатном остове, неионных аналогов.Досліджено процеси зв'язування і поглинання клітинами Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 і M. pneumoniae FH тіофосфатних, дитіофосфатних та метил-фосфонатних аналогів олігодезоксирибонуклеотидів, компле­ментарних «сигнатурним» послідовностям 16S рРНК. Вияв­лено відмінності в ефективності зв'язування даними клітинами тіофосфатних та метилфосфонатних аналогів олігонуклеотидів. Так, рівень сорбції тіофосфатів клітинами A. laidlawii PG-8 перевищував такий метилфосфонатних ана­логів більше ніж в 5 разів. Встановлено факт значного нако­пичення клітинами молікутів тіо- і дитіофосфатних аналогів вивчених олігонуклеотидів. Внутрішньоклітинна концентрація цих сполук у досліджених штамів молікутів перевищувала позаклітинну в 104–105 разів. На основі отриманих еспериментальних даних зроблено припущення про наявність у клі­тинах молікутів двох різних механізмів поглинання аналогів олігонуклеотидів, що несуть від'ємний заряд в рибозофосфатному остові, та неіонних аналогів.Processes of absorption and uptake by cells of Acholeplasma laidlawii PG-8, Mycoplasma fermentans PG-18 and Mycoplasma pneumoniae FH of phosphorothioate, phosphorodithioate and methylphosphonate analogs of oligodeoxynucleotides which are co mplementary to «signature» 16S rRNA sequences have been investigated. Distinctions in efficiency of absorption by given cells of phosphorothioate and methylphosphonate analogs of oligonucleotides are found out. So, the level sorption of thioates by the cells of A. laidlawii PG-8 exceeded a share binding with these cells of methylphosponates more than in 5 times. A fact of significant accumulation by the mollicute cells of thio- and dithioate analogs of oligonucleotides is established. The intracellutar concentration of these compounds at all investigated microorganisms exceeded them extracellular in 104 –105 time. On the basis of received of experimental data the assumption of existence in mollicute cells two of various gears of uptake of analogs of oligonucleotides bearing by negative charge in sugar-phosphate backbone and neutral oligonuc-leotide analogs is stated

Стабілізація дуплексних та триплексних комплексів оліготимідилату ковалентно приєднаним глікозидом імідазофеназину

Синтезовано декатимідилат, який містить на 3'-кінці нуклеозидне похідне імідазофеназину (Pzn). Вивчено вплив ковалентного приєднання барвника на формування комплементарних комплексів (dT)10 – дуплексу з (dA)15 та триплексів з (dA) 15 і poly(dA) ·poly(dT) – в буферних розчинах з нейтральним рН при двох значеннях іонної сили: : μ–0,1 та 1 М. Дослідження здійснювали методом термічної денатурації з використанням абсорбційної та флюоресцентної спектроскопії. Показано, шр залишок Pzn значно стабілізує утворені дуплексні та триплексні комплекси за рахунок інтеркаляції хромофору барвника в послідовності dA та dAdT. Температура плавлення комплексів зростала на 10–12 °С для дуплексних і на 15–20 °С для триплексних структур.Синтезирован декатимидилат, содержащий на 3'-конце нуклеозидное производное имидазофеназина (Pzn). Исследовано влияние ковалентного присоединения красителя на формирование комплементарных комплексов (dT)10 – дуплекса с (dA)15 и триплексов с (dA)15 и poly(dA)·poly(dT) – в буферных растворах с нейтральным рН при двух значениях ионной силы: μ – 0,1 и 1 М. Изучение проводили методом термической денатурации с использованием абсорбционной и флюоресцентной спектроскопии. Показано, что остаток Pzn сильно стабилизирует образующиеся дуплексные и триплексные комплексы за счет интеркаляции хромофора красителя в последовательности dA и dA · dT. Температура плавления комплексов возрастала на 10–12 °С для дуплексных и на 15–20 °С для триплексных структур. Стабилизирующее действие нейтрального имидазофеназина оказалось сравнимым по величине с тем, которое оказывают катионные интеркалирующие красители, присоединяемые к олигонуклеотидам через полиметиленовый линкер.Decathymidylate containing nucleoside derivative of imidazophenazine (Pzn) at the 3'-end was synthesized. The effect of dye covalent attachment on the formation of complementary complexes of (dT)10, namely duplex with (dA)15 and triplex with (dA)15 and poly(dA)·poly(dT), was studied in buffer solutions of neutral pH at ionic strength μ–0,1 and 1 M. Thermal denaturation method using absorption and fluorescence spectroscopy was employed. It has been shown that Pzn residue strongly stabilized duplex and triplex complexes by dye chromophore intercalation into dA and dA·dT sequences. Melting point of complexes increased for 10–12 °C for duplex and 15–20 °C for triplex structures. Stabilizing effect of neutral imidazophenazine was comparable to that of cationic intercalating dyes linked to oligonucleotides via polymethylene linker

Synthesis of Oligodeoxyribo‐ and Oligoribonucleotides According to the H‐Phosphonate Method

Oligonucleotides can be synthesized by condensing a protected nucleoside H‐phosphonate monoester with a second nucleoside in the presence of a coupling agent to produce a dinucleoside H‐phosphonate diester. This can then be converted to a dinucleoside phosphate or to a backbone‐modified analog such as a phosphorothioate or phosphoramidite. This unit discusses four alternative methods for synthesizing nucleoside H‐phosphonate monoesters. The methods are efficient and experimentally simple, and use readily available reagents. The unit describes the activation of the monoesters, as well as competing acylation and other potential side reactions.Peer Reviewedhttps://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/143594/1/cpnc0304.pd

Synthesis and use of disulfide-based H-phosphonate reagent for 3'- and/or 5'-oligonucleotide labelling via mercaptoalkyl linke

Synthesis of new disulfide-based H-phosphonate reagent for solid-phase oligonucleotide functionalization with mercaptopropyl group at one or two termini is described. Using this single reagent, 3'- and 3', 5'-disulfide-linked oligonucleotides were synthesized', disulfide bonds cleaved with dithiothreitol and generated thiol groups labelled with iodoacetamidofluorescein. Tis oligonucleotides containing one or two fluorescein residues at 3'- and 5'-ends were prepared in high yields.Описано синтез нового дисульфідного Н-фосфонатного реагента для твердофазного введення в олігонуклеотиди меркаптопропільних груп по одному чи двох кінцях. З використанням цього реагента було синтезовано З'- та 5'-дисульфідні похідні олігонуклеотидів. Дисульфідні зв'язки розщеплено дитіотреїтолом і тіольні групи, що утворилися, модифіковано йодацетамідофлюоресцеїном. З високим виходом одержано оліго-Т15, які несуть один чи два залишки флюоресиеіну на У- і 5 -кінцях.Описан синтез нового дисульфидного Н-фосфонатного реагента для твердофазного введения в олигонуклеотиды меркаптопропильных групп по одному или двум концам. С использованием этого реагента синтезированы 3',5'-дисульфидные производные олигонуклеотидов. Дисульфидные связи расщеплены дитиотреитолом и образовавшиеся тиольные группы модифицированы иодацетамидофлюоресцеином. С высоким выходом получены олиго-Т15, несущие один или два остатка флюоресцеина на 3' и 5'-концах

Mimicking the action of ribonucleases : studies on RNase A and design of PNA based artificial enzymes

A 3’-deoxy-3’-C-methylenephosphonate modified diribonucleotide is highly resistant to degradation by spleen phosphodiesterase and not cleaved at all by snake venom phosphodiesterase. Despite that both the vicinal 2-hydroxy nucleophile and the 5’-oxyanion leaving group are intact, the 3’-methylenephosponate RNA modification is also highly resistant towards the action of RNase A. Several different approaches were explored for conjugation of oligoethers to PNA with internally or N-terminal placed diaminopropionic acid residues. Using a post PNA-assembly procedures oligoether attachment to both N-terminal and sidechain amino groups was achieved. Use of a new oligoether functionalized amino acid allows inclusion of oligoether conjugates during on-line machine assisted synthesis, allowing combination of methods for attachment of different oligoethers and co-conjugation of neocuproine cleaver. We have previously shown that PNA-neocuproine conjugates can act as artificial RNA restriction enzymes (PNAzyme). In the present study we have additionally conjugated the PNA with different entities and also constructed systems where the PNA is designed to clamp the target RNA forming a triplex. Some conjugations are detrimental for the activity while most are silent which means that conjugation can be done to alter physical properties without losing activity. Conjugation with a single oligoether close to the neocuproine does enhance the rate almost two folds compared to the system without the oligoether. The systems designed to clamp the RNA target by forming a triplex are effective if the clamping part is not too long. Changing the direction of a closing base pair, from a GC to a CG pair, enhances the rate of cleavage with a clamping PNAzyme and without compromising the selectivity, leading to the so far most efficient artificial nuclease reported. Tris(2-aminobenzimidazole) conjugates with antisense oligonucleotides are effective site-specific metal-free RNA cleavers. Here we investigate conjugates with peptide nucleic acids (PNA). In a first study we show that RNA degradation occurs with similar rates and substrate specificities as in experiments with DNA conjugates. In a second study we show that tris(2-aminobenzimidazole) based artificial nucleases cleave RNA substrates, which form a bulge upon binding to the PNA, with turnover of substrate and a cleavage rate that is also dependent on the bulge sequence. Two methods of analysis for the kinetics, based on IE-HPLC separation of oligonucleotide fragments and analysis of Cy5-labelled oligonucleotide fragments by denaturating PAGE on a DNA sequencer respectively are also compared. To be able to target microRNAs also at stages where these are in a double stranded or hairpin form we have looked at BisPNA designed to clamp the target and give sufficient affinity to allow for strand invasion. We show that BisPNA complexes are more stable with RNA than with DNA. In addition, 24-mer BisPNA (AntimiR) constructs form complexes with a hairpin RNA that is a model of the microRNA miR-376b, suggesting that PNA-clamping may be an effective way of targeting microRNAs

WWOX: a tumor suppressor gene mutated in multiple cancers

The present invention provides the isolation and cloning of WWOX, a novel WW domain-containing protein mapping to human chromosome 16q23.3–24.1, a region frequently affected in several cancers. This gene encodes a tumor suppressor with apoptotic functions. The invention provides WWOX nucleic acid- and polypeptide-based cancer therapies. The invention also provides methods for cancer detection, diagnosis and prognosis involving WWOX nucleic acids and polypeptides.Board of Regents, University of Texas Syste