Sonic Hedgehog Is a Member of the Hh/DD-Peptidase Family That Spans the Eukaryotic and Bacterial Domains of Life.

Sonic Hedgehog (Shh) coordinates Zn2+ in a manner that resembles that of peptidases. The ability of Shh to undergo autoproteolytic processing is impaired in mutants that affect the Zn2+ coordination, while mutating residues essential for catalytic activity results in more stable forms of Shh. The residues involved in Zn2+ coordination in Shh are found to be mutated in some individuals with the congenital birth defect holoprosencephaly, demonstrating their importance in development. Highly conserved Shh domains are found in parts of some bacterial proteins that are members of the larger family of DD-peptidases, supporting the notion that Shh acts as a peptidase. Whereas this Hh/DD-peptidase motif is present in Hedgehog (Hh) proteins of nearly all animals, it is not present in Drosophila Hh, indicating that Hh signaling in fruit flies is derived, and perhaps not a good model for vertebrate Shh signaling. A sequence analysis of Hh proteins and their possible evolutionary precursors suggests that the evolution of modern Hh might have involved horizontal transfer of a bacterial gene coding of a Hh/DD-peptidase into a Cnidarian ancestor, recombining to give rise to modern Hh

Signaling Domain of Sonic Hedgehog as Cannibalistic Calcium-Regulated Zinc-Peptidase

<div><p>Sonic Hedgehog (Shh) is a representative of the evolutionary closely related class of Hedgehog proteins that have essential signaling functions in animal development. The N-terminal domain (ShhN) is also assigned to the group of LAS proteins (LAS = Lysostaphin type enzymes, D-Ala-D-Ala metalloproteases, Sonic Hedgehog), of which all members harbor a structurally well-defined center; however, it is remarkable that ShhN so far is the only LAS member without proven peptidase activity. Another unique feature of ShhN in the LAS group is a double- center close to the zinc. We have studied the effect of these calcium ions on ShhN structure, dynamics, and interactions. We find that the presence of calcium has a marked impact on ShhN properties, with the two calcium ions having different effects. The more strongly bound calcium ion significantly stabilizes the overall structure. Surprisingly, the binding of the second calcium ion switches the putative catalytic center from a state similar to LAS enzymes to a state that probably is catalytically inactive. We describe in detail the mechanics of the switch, including the effect on substrate co-ordinating residues and on the putative catalytic water molecule. The properties of the putative substrate binding site suggest that ShhN could degrade other ShhN molecules, e.g. by cleavage at highly conserved glycines in ShhN. To test experimentally the stability of ShhN against autodegradation, we compare two ShhN mutants <i>in vitro</i>: (1) a ShhN mutant unable to bind calcium but with putative catalytic center intact, and thus, according to our hypothesis, a constitutively active peptidase, and (2) a mutant carrying additionally mutation E177A, i.e., with the putative catalytically active residue knocked out. The <i>in vitro</i> results are consistent with ShhN being a cannibalistic zinc-peptidase. These experiments also reveal that the peptidase activity depends on .</p></div

Insights into the role of metal ions

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage: Welche Wirkung haben Metall-Ionen auf die Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen des Proteins ShhN, der N-terminalen Signal- Domäne von Sonic Hedgehog? Zur Beantwortung wurden molekulare Strukturen von ShhN mit verschiedenen Computer-gestützten Methoden analysiert. Die Analysen sagen einige überraschende Eigenschaften von ShhN vorher. Zuerst legen die Analysen nahe, dass ShhN eine Zink-Protease ist, deren katalytisches Zentrum durch die Bindung von Calcium-Ionen reguliert wird. Speziell ändert die Bindung des zweiten Calcium-Ions die Konformation des Zink-Zentrums und beeinflusst so vermut- lich die Bindung des Substrats. Diese Konformationsänderung kaskadiert vom Calcium- Ion zum katalytisch Zink-Zentrum über mehrere Residuen und destabilisiert die Substrat- Bindestelle und das Zink-gebundene katalytische Wasser-Molekül. Änderungen des elek- trostatischen Potenzials um das Zink-Zentrum in Abhängigkeit von der Calcium-Bindung weisen hin auf eher unpolare Substrate, z.B. den C-Terminus von ShhN. ShhN könnte also ShhN-Moleküle abbauen, und auf diese Weise seinen Konzentrationsgradienten än- dern. Die Implikationen des beschriebenen neuartigen Mechanismus der Schaltung von ShhN über Calcium-Ionen für die biologische Funktion des Proteins sind noch weitgehend unverstanden, und erfordern weitere Forschung. Die Flexibilität von ShhN-Monomeren und -Dimeren hängt stark ab von der Zahl der gebun- denen Calcium-Ionen. Im Besonderen sind die Calcium-bindenden Schleifen von ShhN davon betroffen. ShhN-Dimere werden stabilisiert durch das Cardin-Weintraub-Motiv am N-Terminus und durch Wechselwirkungen mit hydrophoben Residuen an der Schnittstelle zwischen den Monomeren. Die schwächere Konservierung von I48 in Wirbeltieren kön- nte ein Hinweis sein auf eine wichtige Rolle dieses Residuums in der Oligomerisierung von ShhN. Die Nähe von Calcium-Ionen zur Dimerisierungs-Region sorgt für ein positives elektrostatisches Potenzial und könnte so die Bindung von Proteoglykanen fördern. Ins- gesamt wird ein Modell der Multimerisierung von ShhN vorgeschlagen, das über mehrere Kontrollmechanismen verfügt, die experimentell getestet werden sollten.The present work studies the effect of metal ions on the structure, dynamics and inter- actions of the protein ShhN, the N-terminal signaling domain of Sonic Hedgehog. To accomplish this task, molecular structures of ShhN proteins were analyzed with a set of computational methods, revealing new features of ShhN proteins. The results suggest that, ShhN is an enzyme with a zinc catalytic center that is regulated by the binding of the calcium ions. Explicitly, the binding of the second calcium ion involves a conformational change that is accompanied by a significant perturbation of the putative catalytic center, possibly affecting substrate stabilization. The dragging of E127 towards the calcium center implies the pulling of H135 with it and the disruption of the hydrogen bond between G128 and H141. Besides, the distance between residues E177 and H135 increases and therefore, the well-defined position of the catalytic water molecule is lost destabilizing the zinc environment. Electrostatic potential differences among calcium states suggest the possible binding of nonpolar substrates. One of the predictions is that ShhN autodegradates tuning its own concentration gradient. This possibility does not rule out, of course, the existence of other mechanisms that govern ShhN concentration gradient. The novel switching mechanism proposed could have many implications in the biological function of HhN proteins, but these are not well understood and require further research. Both ShhN monomers and dimers show a flexibility pattern that strongly depends on the number of calcium ions. Specially, calcium binding loops reflect this behavior. The Cardin- Weintraub motif located within the N-terminal of ShhN proteins together with buried hydrophobic residues at the interface lead to an stable complex that enhances ShhN dimerization. The lower degree of conservation of I48 in vertebrate homologs might indicate that this is a hot spot residue with an important role in ShhN oligomerization. The presence of the calcium ions at the dimeric interface can promote ShhN-proteoglycan interactions providing a large positively charged region which is the ideal scenario for the binding of these molecules. Taken all together, a multimerization model where different levels of interaction can control the way that ShhN multimers form is proposed. However, this model has yet to be tested

Methoden zur Vorhersage von komplexen biomolekularen Strukturen

Die erste hochaufgelöste Struktur eines Proteins wurde 1985 von John Kendrew und Max Perutz aufgelöst. Seitdem ist die experimentelle Aufklärung ein wichtiger Bestandteil der biologischen Forschung. Allerdings ist die Aufklärung der Strukturen von biomoleku- laren Komplexen sehr schwierig. Diese Strukturen sind jedoch immens wichtig für das Verständnis vieler biologischer Phänomene auf molekularer Ebene. Aus diesem Grund hat sich ein Forschungsfeld entwickelt, das computergestützte Modellierung zur Vorher- sage von biomolekularen Strukturen verwendet. In dieser Promotionsschrift sollten Methoden zur Vorhersage von komplexen biomolekularen Strukturen entwickelt werden. Diese Methoden basieren auf drei unter- schiedlichen Ansätzen: Die erste Methode wurde für Proteine entwickelt, die aus mehreren Domänen bestehen. Die Methode nutzt vorhandene Strukturen der einzelnen Domänen und experimentelle Daten, die geometrische Relationen der Domänen abbilden, und ermöglicht die Unter- suchung konformationeller Änderungen bedingt durch äußere Einflüsse, wie beispielsweise das Zuführen eines Substrates. Als Fallbeispiel wurde die Konformation des flexiblen zwei-Domänen Proteins peptidylprolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1 (Pin1) untersucht, sowie die Änderung als Reaktion auf die Zugabe des Substrates polyethy- lene glycol (PEG). Die zweite Methode basiert auf dem neuen Verfahren Direct Coupling Analysis (DCA), das es ermöglicht geometrische Kontakte von Aminosäuren anhand eines multiplen Sequenzalignments (MSA) vorherzusagen. DCA nutzt eine Korrektur zur Vermeidung einer Stichprobenverzerrung bedingt durch die Auswahl der Sequenzen für das MSA. Die hier vorgestellte Optimierung ermöglicht eine robustere Vorhersage der geometrischen Kontakte. Die optimierte Methode wurde für die Analyse von Human Immunodeficiency Virus-1 Envelope Protein (HIV-1 Env) eingesetzt. Die letzte Methode wurde entwickelt, um Binderegionen des negativ geladenen Heparansulfates an Proteinen vorherzusagen. Dafür haben wir ein Modell entwickelt, das auf der elektrostatischen Wechselwirkung basiert. Die Fallbeispiele sind hier ver- schiedene Heparansulfat bindenden Proteine, wie das Chemokine CCL3 und den Hedgehog Proteinen. Insgesamt wird gezeigt, dass für verschiedene Arten von biomolekularer Strukturen und Komplexe moderne computergestützte Methoden Einsichten liefern, die im Einklang mit Experimenten stehen

Entwicklung von Methoden für das computergestützte Design von Mimotopen

Die wachsende Menge an experimentell aufgeklärten Protein-Protein-Komplexen oder allgemeiner: Protein-Ligand-Komplexen, erlaubt das immer genauere Studium von biomolekularen Wechselwirkungen. Eine Teilmenge der existierenden Wechselwirkungen bilden die für die adaptive Immunantworten wichtigen Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen. Die chemischen Gruppen an der Oberfläche der Antigene entscheiden über die spezifischen Wechselwirkungen mit Antikörpern, und werden als antigene Determinanten oder Epitope bezeichnet. Die dazu komplementären Bindestellen auf den Antikörpern werden als Paratope bezeichnet. Häufig verwendet man den Begriff „Epitop“ allgemein für Molekülteile, die spezifisch erkannt werden. Die Spezifität der Epitope wird sowohl durch die geometrische Anordnung als auch durch die chemische Konfiguration der monomeren Gruppen bestimmt. Mimotope sind synthetisch hergestellte Proteine, die die strukturellen Erkennungsmerkmale der Epitope nachahmen und somit z.B. eine definierte Immunantwort auslösen können. Beispielsweise ist es nun möglich, Epitope bis zur atomaren Auflösung zu identifizieren und nach ähnlichen Strukturmotiven auf anderen Proteinstrukturen zu suchen. Diese Art des Strukturvergleichs eröffnet interessante Anwendungen: Epitope lassen sich ggf. auf andere Trägermoleküle transplantieren, oder es könnten Kreuzreaktivitäten vorhergesagt werden. Entscheidend für diese Ansätze ist die Verfügbarkeit einer Methode, mit der sich Strukturmotive schnell und genau vergleichen lassen. Die Entwicklung einer solchen Methode (EpitopeMatch) ist das Ziel dieser Promotionsarbeit. Im Einzelnen soll EpitopeMatch folgende Eigenschaften besitzen: • Einbeziehung geometrischer und chemischer Ähnlichkeit. • Flexible Definition von i. Allg. diskontinuierlichen Epitopen auf der Grundlage bekannter Komplexstrukturen. • Effiziente Suche auf großen Strukturdatenbanken. • Möglichkeit der Transplantation vollständiger Epitope. • Verknüpfung der Fundstellen mit funktionellen biologischen Daten