Fish responses to viruses : From interferon to T-cells

Viruses affecting farmed fish species, such as the rainbow trout, have been studied extensively because they cause significant economic losses. Studies on vaccines developed against Viral Hemorrhagic Septicemia (VHS) have provided evidence of an effective and specific response based on neutralizing antibodies, as well as of an immune memory. Various techniques of differential transcript analysis were used to investigate the non-specific leukocyte response to the VHS virus in trout. As in mammals, this response was dependent on interferon-responsive genes. A VDJ junction spectratyping approach of transcripts of the specific T-cell antigen receptor (TCR) was also developed to examine the specific cellular response in rainbow trout. This approach was used to show the existence of complex antiviral T-cell responses in fish.Les virus des poissons d'intérêt agronomique, comme la truite arc-en-ciel, ont été bien étudiés parce qu'ils causent des dommages significatifs dans les élevages. Ainsi, des vaccins ont été développés contre la Septicémie Hémorragique Virale (SHV), montrant l'existence d'une réponse efficace et spécifique basée sur les anticorps neutralisants et celle d'une mémoire immunitaire. La réponse non spécifique des leucocytes de truite induite par le virus de la SHV a pu être explorée par différentes techniques d'analyse différentielle des transcrits. Il a ainsi été démontré que les gènes induits par l'interféron orchestrent cette réponse, comme c'est aussi le cas chez les mammifères. Enfin, une stratégie de spectratypage des longueurs de jonctions VDJ des transcrits du récepteur spécifique de l'antigène des lymphocytes T (TCR) a été développée pour l'étude de la réponse cellulaire spécifique chez la truite arc-en-ciel. Cette approche a permis de démontrer l'existence de réponses T antivirales complexes chez les poissons

De nouveaux algorithmes de tri par transpositions

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal

Le maintien de la stabilité génomique du plastide : un petit génome d’une grande importance

Chez les plantes, le génome plastidique est continuellement exposé à divers stress mutagènes, tels l’oxydation des bases et le blocage des fourches de réplication. Étonnamment, malgré ces menaces, le génome du plastide est reconnu pour être très stable, sa stabilité dépassant même celle du génome nucléaire. Néanmoins, les mécanismes de réparation de l’ADN et du maintien de la stabilité du génome plastidique sont encore peu connus. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons développé une approche, basée sur l’emploi de la ciprofloxacine, qui nous permet d’induire des bris d’ADN double-brins (DSBs) spécifiquement dans le génome des organelles. En criblant, à l’aide de ce composé, une collection de mutants d’Arabidopsis thaliana déficients pour des protéines du nucléoïde du plastide, nous avons identifié 16 gènes vraisemblablement impliqués dans le maintien de la stabilité génomique de cette organelle. Parmi ces gènes, ceux de la famille Whirly jouent un rôle primordial dans la protection du génome plastidique face aux réarrangements dépendants de séquences de microhomologie. Deux autres familles de gènes codant pour des protéines plastidiques, soit celle des polymérases de types-I et celle des recombinases, semblent davantage impliquées dans les mécanismes conservateurs de réparation des DSBs. Les relations épistatiques entre ces gènes et ceux des Whirly ont permis de définir les bases moléculaires des mécanismes de la réparation dépendante de microhomologies (MHMR) dans le plastide. Nous proposons également que ce type de mécanismes servirait en quelque sorte de roue de secours pour les mécanismes conservateurs de réparation. Finalement, un criblage non-biaisé, utilisant une collection de plus de 50,000 lignées mutantes d’Arabidopsis, a été réalisé. Ce criblage a permis d’établir un lien entre la stabilité génomique et le métabolisme des espèces réactives oxygénées (ROS). En effet, la plupart des gènes identifiés lors de ce criblage sont impliqués dans la photosynthèse et la détoxification des ROS. Globalement, notre étude a permis d’élargir notre compréhension des mécanismes du maintien de la stabilité génomique dans le plastide et de mieux comprendre l’importance de ces processus.The plant plastidial genome is constantly threatened by many mutagenic stresses, such as base oxidation and replication fork stalling. Despite these threats, the plastid genome has long been known to be more stable than the nuclear genome, suggesting that alterations of its structure would have dramatic consequences on plant fitness. At the moment, little is known about the genes and the pathways allowing such conservation of the organelle genome sequences. To gain insight into these mechanisms, we developed an assay which uses ciprofloxacin, a gyrase inhibitor, to generate DNA double-strand breaks (DSBs) exclusively in plant organelles. By screening mutants deficient for proteins composing the plastid nucleoid on ciprofloxacin, we were able to identify 16 candidate genes, most likely involved in the repair of DSBs in plastid. Among these genes, those of the Whirly family of single-stranded DNA binding proteins are shown to be key factors in protecting the genome from error-prone microhomology mediated repair (MHMR). Two other family of proteins, the plastid type-I polymerases and the plastid recombinases, seem to be involved in the conservative repair pathways. The evaluation of the epistatic relationship between those two genes and the Whirly genes led us to define the molecular basis of MHMR and to propose that they might act as a backup system for conservative repair pathways. Finally, a non-biased screen, using 50,000 different insertion lines, allowed the identification of numerous genes that were already associated with ROS homeostasis, suggesting a link between DNA repair and ROS imbalance. Globally, our study shed light on the mechanisms that allow the maintenance of plastid genome, while explaining the importance of such conservation of the plastid genome

Étude de l’évolution des génomes par duplications, pertes et réarrangements

La duplication est un des évènements évolutifs les plus importants, car elle peut mener à la création de nouvelles fonctions géniques. Durant leur évolution, les génomes sont aussi affectés par des inversions, des translocations (incluant des fusions et fissions de chromosomes), des transpositions et des délétions. L'étude de l'évolution des génomes est importante, notamment pour mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués, les types d'évènements qui sont les plus fréquents et quels étaient les contenus en gènes des espèces ancestrales. Afin d'analyser ces différents aspects de l'évolution des génomes, des algorithmes efficaces doivent être créés pour inférer des génomes ancestraux, des histoires évolutives, des relations d'homologies et pour calculer les distances entre les génomes. Dans cette thèse, quatre projets reliés à l'étude et à l'analyse de l'évolution des génomes sont présentés : 1) Nous proposons deux algorithmes pour résoudre des problèmes reliés à la duplication de génome entier : un qui généralise le problème du genome halving aux pertes de gènes et un qui permet de calculer la double distance avec pertes. 2) Nous présentons une nouvelle méthode pour l'inférence d'histoires évolutives de groupes de gènes orthologues répétés en tandem. 3) Nous proposons une nouvelle approche basée sur la théorie des graphes pour inférer des gènes in-paralogues qui considère simultanément l'information provenant de différentes espèces afin de faire de meilleures prédictions. 4) Nous présentons une étude de l'histoire évolutive des gènes d'ARN de transfert chez 50 souches de Bacillus.Gene duplication is one of the most important types of events affecting genomes during their evolution because it can create novel gene function. During the evolution process, genomes are also affected by inversions, translocations (including chromosome fusions and fissions), transpositions and deletions. Studying the evolution of genomes is important to get a better understanding of the biological mechanisms involved, which types of events are more frequent than others and what was the gene content in the ancestral species just to name a few. In order to analyze these different aspects of genome evolution, efficient algorithms need to be developed to infer ancestral genomes, evolutionary histories, homology relationships between genes and to compute distances between genomes. In this thesis, four different projects related to the study and analysis of genome evolution are presented: 1) We developed two algorithms to solve problems related to whole genome duplication: one that generalizes the genome halving problem to gene losses, and one that allows to compute the double distance with losses. 2) We developed a new method to infer evolutionary histories of orthologous tandemly arrayed gene clusters. 3) We proposed a new graph-theoretic approach to infer inparalogs that simultaneously considers the information given by multiple species in order to make better inferences of inparalogous gene pairs. 4) We studied the evolutionary history of the tRNA genes of 50 Bacillus strains

L'anémie hémolytique congénitale non sphérocytaire par déficience en pyruvate kinase (PK)

L’anémie hémolytique résulte d'une fragilité anormale du globule rouge. L'intégrité cellulaire des érythrocytes dépend d'une assemblée protéique appartenant à plusieurs systèmes fonctionnels distincts. De nombreuses enzymopathies décrites pour chacun de ces systèmes ont été associées à des syndromes hémolytiques. Le déficit en pyruvate kinase érythrocytaire (PK-R), une pathologie héréditaire transmise par récessivité autosomique, est le plus commun des défauts enzymatiques associés à l'anémie hémolytique congénitale non sphérocytaire (AHCNS). La présence d'une mutation PK-R originale ou précédemment décrite a été scrutée chez un patient d'origine Québécoise (A.C.) présentant le phénotype d'une condition hémolytique sévère. La région codante et certaines séquences introniques de l'isoenzyme PK-R ont été investiguées selon une méthodologie initialement optimisée, et impliquant notamment la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), le clonage des fragments d'ADN issus des amplifications PCR ou leur séquençage direct. L'analyse génétique, compliquée par l'introduction d'artéfacts de séquences, a révélé l'absence de mutations structurales spécifiques au patient A.C. Des analyses cinétiques et immunologiques complémentaires aux études génétiques décrites, ont permis d'élaborer l'hypothèse d'une mutation portant sur les régions régulatrices du gène PK-L, spécifiques à l'isoenzyme érythrocytaire. Une corrélation est envisageable entre la nature de la mutation, la sévérité du tableau clinique et l'aspect morphologique des globules rouges anormaux, tel qu'observé par microscopie électronique à balayage. Trois variants non pathologiques (388ACC?TCC; 393ATA?ATC; 1267CGG?GCG) ont été systématiquement identifiés chez l'individu anémique et tous les sujets normaux testés d'origine Canadienne-Française, soulevant à chaque fois l'épineuse question des erreurs publiées versus polymorphismes naturels. Certaines évidences favorisent la première alternative. La mutation silencieuse (1705AGG?CGG) rapportée au sein des populations japonaises a également été identifiée chez un sujet d'origine vietnamienne établi en Estrie. Le même polymorphisme était absent des génomes Canadiens-Français testés, suggérant, pour ce variant, une hétérogénéité allélique spécifique aux populations orientales. La séquence du promoteur spécifique à l'isoenzyme PK-L est rapportée. Des séquences fortement homologues aux éléments régulateurs PKL-I (L1), PKL-II (L3) et PKL-III (L4) du promoteur L identifiés chez le rat, ont été reconnues en des positions équivalentes du promoteur L humain. De même, une séquence du promoteur correspond à plus de 80% à un élément de réponse aux hydrates de carbone ("carbohydrate response element") caractérisé chez le rat par son implication dans le contrôle du gène par la diète et les hormones. Cette conservation des séquences entre espèces suggère un mode de contrôle similaire de la spécificité hépatique de l'expression du gène PK-L. Au cours des travaux portant sur l'identification des mutations, des bandes supplémentaires sont spécifiquement apparues dans le patron électrophorétique de la réaction d'amplification PCR impliquant l'exon 6 de 4 patients sur 5. Ces fragments n'ont pas été générés avec sept individus contrôles et 2 sujets hétérozygotes pour le déficit en pyruvate kinase, suggérant une relation étroite des séquences supplémentaires avec la condition hémolytique des patients. Ces marqueurs génétiques, désignés hmf1 et hmf2 ("hemolysis related factors 1 et 2"), ont été clonés puis séquencés. Ils couvrent des séquences de 346 (hmf1) et 351 (hmf2) paires de bases homologues respectivement à la région 3' non codante du gène du récepteur PDGF (PDGFr) et à la région 5' codante du gène de l'interféron-?A de boeuf (BOVIFN-?A). La comparaison des profils d'hydrophobicité des acides aminés correspondants des protéines hmf2 et BOVIFN-?A révèle leur similarité structurelle. Par bavardage de type "Northern", un ARNm de 3,2Kb est également détecté pour hmf2. Les fragments supplémentaires amplifiés sont générés à partir d'une seule des deux amorces utilisées pour l'amplification de l'exon 6 (PKLS6). En modifiant les conditions PCR de l'exon 6, les bandes supplémentaires sont également détectées chez les individus asymptomatiques. L'hypothèse d'un réarrangement, spécifique aux sujets anémiques, des gènes correspondant aux marqueurs hmf1 et hmf2 est proposée pour expliquer ces résultats. La nature déduite des gènes hmf1 et hmf2 combinée aux évidences de leur réarrangement chez les patients anémiques, suggèrent une implication physiologique des deux marqueurs génétiques. Nous proposons leur appartenance au système responsable de l'érythropoïèse, dans un but compensatoire de l'anémie hémolytique. Certaines coïncidences suggèrent également la corrélation des réarrangements hmf1 et hmf2 avec les mécanismes de l'oncogénèse