PROPHECY—a yeast phenome database, update 2006

Connecting genotype to phenotype is fundamental in biomedical research and in our understanding of disease. Phenomics—the large-scale quantitative phenotypic analysis of genotypes on a genome-wide scale—connects automated data generation with the development of novel tools for phenotype data integration, mining and visualization. Our yeast phenomics database PROPHECY is available at . Via phenotyping of 984 heterozygous diploids for all essential genes the genotypes analysed and presented in PROPHECY have been extended and now include all genes in the yeast genome. Further, phenotypic data from gene overexpression of 574 membrane spanning proteins has recently been included. To facilitate the interpretation of quantitative phenotypic data we have developed a new phenotype display option, the Comparative Growth Curve Display, where growth curve differences for a large number of mutants compared with the wild type are easily revealed. In addition, PROPHECY now offers a more informative and intuitive first-sight display of its phenotypic data via its new summary page. We have also extended the arsenal of data analysis tools to include dynamic visualization of phenotypes along individual chromosomes. PROPHECY is an initiative to enhance the growing field of phenome bioinformatics

Étude des anomalies du développement humain# un modèle d’analyse phénotypique

Depuis le début des années 90, le projet génome humain a permis l’émergence de nombreuses techniques globalisantes porteuses du suffixe –omique : génomique, transcriptomique, protéomique, épigénomique, etc.… L’étude globale de l’ensemble des phénotypes humains (« phénome ») est à l’origine de nouvelles technologies constituant la « phénomique ». L’approche phénomique permet de déterminer des liens entre des combinaisons de traits phénomiques. Nous voulons appliquer cette approche à l’étude des malformations humaines en particulier leurs combinaisons, ne formant des syndromes, des associations ou des séquences bien caractérisés que dans un petit nombre de cas. Afin d’évaluer la faisabilité de cette approche, pour une étude pilote nous avons décidé d’établir une base de données pour la description phénotypique des anomalies foetales. Nous avons effectué ces étapes : o Réalisation d’une étude rétrospective d’une série d’autopsies de foetus au CHU Sainte- Justine (Montréal, QC, Canada) entre 2001-2006 o Élaboration de trois thésaurus et d’une ontologie des anomalies développementales humaines o Construction une base de données en langage MySQL Cette base de données multicentrique accessible sur (http://www.malformations.org), nous permet de rechercher très facilement les données phénotypiques des 543 cas observés porteurs d’une anomalie donnée, de leur donner une description statistique et de générer les différents types d’hypothèses. Elle nous a également permis de sélectionner 153 cas de foetus malformés qui font l’objet d’une étude de micropuce d’hybridation génomique comparative (aCGH) à la recherche d’une anomalie génomique.Since the early 90s, the Human Genome Project (HGP) has allowed the development of numerous worldwide techniques which carried the suffix “omic”: genomic, transcriptomic, proteomic, epigenomic, etc…. The global investigation of the sets of human phenotypes (phenome) is called phenomic. With phenomic studies we should be able to determine the links among similar phenotypic groups. We wish to apply this approach to human dysmorphology, particularly malformation combinations, which form characteristic malformation associations, malformation sequences, malformation syndromes or malformation disorders only in a minority of cases. As a graduate student research project, we decided to perform a retrospective study of the sets of pathology reports including 543 fetuses autopsied in the Department of Pathology of CHU Sainte-Justine (Montreal, QC, Canada) between 2001 and 2006. We have established an open Malformation Database (MDB) which can be accessed at http://www.malformations.org. To achieve this, we conducted the following steps: o Realization of a retrospective study of fetopathology reports for fetal malformations. o Development of an ontology along with three thesauruses of human developmental anomalies. o Implementation of these thesauruses and ontology in the MySQL system. This hypothesis-generating database allows us to easily retrieve the fetal cases (phenotypic data) with anomalies, calculate the frequencies of these anomalies, and evaluate the feasibility of the phenomic approach to human dysmorphogenesis. We were able as well to select 153 cases of malformed fetuses which will be the subject of aCGH array study for genomic research of human anomalies

Dom34 Rescues Ribosomes in 3′ Untranslated Regions

SummaryRibosomes that stall before completing peptide synthesis must be recycled and returned to the cytoplasmic pool. The protein Dom34 and cofactors Hbs1 and Rli1 can dissociate stalled ribosomes in vitro, but the identity of targets in the cell is unknown. Here, we extend ribosome profiling methodology to reveal a high-resolution molecular characterization of Dom34 function in vivo. Dom34 removes stalled ribosomes from truncated mRNAs, but, in contrast, does not generally dissociate ribosomes on coding sequences known to trigger stalling, such as polyproline. We also show that Dom34 targets arrested ribosomes near the ends of 3′ UTRs. These ribosomes appear to gain access to the 3′ UTR via a mechanism that does not require decoding of the mRNA. These results suggest that ribosomes frequently enter downstream noncoding regions and that Dom34 carries out the important task of rescuing them

The use of high-throughput microscopy in the characterisation of phenotypes associated with the Unfolded Protein Response in Saccharomyces cerevisiae

Proteins traversing the secretory pathway begin their passage in the endoplasmic reticulum (ER) where they must be correctly folded and processed to pass quality control measures. Complications with this process can result in the accumulation of misfolded proteins, commonly referred to as ER-stress, which has been associated with a number of diseases. The unfolded protein response (UPR) is the cell’s mechanism of dealing with ER-stress and is activated via the IRE1-HAC1 pathway in yeast. Ire1p is the ER-stress sensor and upon recognising misfolded proteins Ire1 oligomerises and forms local clusters. Activated Ire1p then splices out an inhibitory intron from the UPR specific transcription factor Hac1p which goes on to initiate downstream responses to alleviate ER-stress. Here we utilise high-throughput microscopy and UPR-specific GFP reporter systems to characterise the UPR in the yeast Saccharomyces cerevisiae. High-throughput microscopy and automated image analysis is increasingly being used as a screening tool for investigating genome-wide collections of yeast strains, including the yeast deletion mutant array and the yeast GFP collection. We describe the use of GFP labelled Ire1p to visualise cluster formation as a reporter for early UPR recognition of misfolded proteins, as well as a GFP controlled by a Hac1p responsive promoter to measure downstream UPR activation. These UPR-specific GFP reporter systems were used to screen a collection of non-essential gene deletion strains, identifying gene deletions that induce UPR activation and thus are likely to function in the early secretory pathway. This included well known components such as the ALG members of the glycosylation pathway and various ER chaperones such as LHS1 and SCJ1. Additionally this analysis revealed 44 previously uncharacterised genes, suggesting there are still processes related to the secretory pathway that are yet to be described. Moreover, by inducing ER-stress in this screening system we revealed genes required for the normal activation of the UPR including ribosomal/translation and chromatin/transcriptionally related genes, as well as various genes from throughout the secretory pathway. Furthermore, we screened a collection of ~4000 strains, each expressing a different GFP fusion protein, under ER-stress conditions to identify protein expression and localisation changes induced by the UPR. Comparison to UPR deficient Δhac1 cells uncovered a set of UPR specific targets including 26 novel UPR targets that had not been identified in previous studies measuring changes at the transcript level. As part of this work, we developed a dual red fluorescent protein system to label cells for automated image segmentation to enable single cell phenotype measurements. Here we describe the use of texture analysis as a means of increasing automation in the identification of phenotypic changes across the proteome. These novel techniques may be more widely applied to screening GFP collections to increase automation of image analysis, particularly as manual annotation of phenotypic changes is a major bottleneck in high-throughput screening. The results presented here from microscopy based screening compare well with other techniques in the literature, but also provide new information highlighting the synergistic effects of integrating high-throughput imaging into traditional screening methodologies

Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales

En esta Tesis Doctoral se propone una alternativa a la coyuntura actual de rechazo social frente al uso de OMGs en la industria agroalimentaria, mediante la demostración y el desarrollo de un nuevo concepto sobre el uso de las técnicas de biología molecular en la obtención de levaduras modificadas genéticamente, el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular. La idea básica de este nuevo concepto es simple y se basa en imitar a la propia naturaleza en su constante evolución, pero acelerando y dirigiendo el proceso evolutivo con el objeto de seleccionar en un corto periodo de tiempo aquellos cambios genéticos que específicamente hayamos diseñado a escala molecular. Las levaduras no son una entidad invariable en el tiempo, al contrario, como todos los organismos vivos evolucionan con el tiempo. Mediante esta nueva metodología que hemos desarrollado, se consigue acelerar el proceso evolutivo, pues las modificaciones genéticas que hemos introducido se podrían haber efectuado espontáneamente por la levadura en su entorno natural como consecuencia de procesos de recombinación, duplicación o eliminación de elementos genéticos a lo largo de su ciclo reproductivo, aunque indudablemente se habrían perdido sin la presencia de determinadas condiciones de selección y, dada la baja probabilidad de que esos eventos ocurrieran, habrían necesitado de un inmenso periodo de tiempo. Se ha demostrado el concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, mediante la construcción e integración cromosómica de un casete de selección basado en la sobreexpresión del gen YAP1, que da origen a un marcador dominante que confiere resistencia a diversos compuestos tóxicos para las levaduras, tales como cicloheximida y cerulenina. Para el desarrollo de dicho casete de selección nos hemos impuesto y respetado las siguientes condiciones: 1) Utilización de la capacidad de recombinación homóloga de las levaduras del género Saccharomyces; 2) Utilización de material genético procedente exclusivamente de la propia cepa de levadura a evolucionar; 3) El material genético no ha de sufrir ningún paso intermedio de clonaje o expresión en otros sistemas biológicos. Una vez cumplidas todas estas condiciones, las cepas resultantes no deberían responder a la definición oficial de organismos modificados genéticamente de la Unión Europea: ¿organismos en los que su material genético ha sido alterado de una manera que no sucede de forma natural mediante los procesos de reproducción sexual y/o recombinación natural¿. Para alcanzar el objetivo fundamental del proyecto, hemos trabajado inicialmente con un sistema modelo más sencillo, como es el caso de una cepa de una levadura de laboratorio, y a continuación hemos abordado la misma aproximación experimental pero trabajando con una levadura que se emplea en la producción industrial de cerveza tipo ¿lager¿. La metodología experimental que se ha diseñado ha consistido en obtener, sólo mediante reacciones de PCR, una construcción que, posteriormente a su inserción cromosómica mediante recombinación homóloga, pone al gen YAP1 bajo el control de un promotor fuerte de un gen de la ruta de la glicólisis, el promotor del gen PGK1. Se determinó si la sobreexpresión del gen YAP1 en la cepa cervecera evolucionada, era capaz de disminuir la aparición espontánea de mutantes deficientes en respiración (¿petites¿) durante la fermentación del mosto cervecero. La continuada reutilización industrial de la levadura cervecera está asociada con un incremento en la frecuencia de la aparición de ¿petites¿, con el consiguiente efecto negativo sobre el proceso fermentativo. Según los resultados obtenidos, la cepa evolucionada, presenta claramente una menor formación de ¿petites¿ durante su reutilización a lo largo de 10 microfermentaciones sucesivas, con respecto a la cepa parental. Una vez demostrada la viabilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular, el paso siguiente consistió en la aplicación de dicha metodología al desarrollo de levaduras con características de interés industrial. Se han diseñado reorganizaciones cromosómicas sobre 3 tipos de levaduras industriales: a) Una levadura de producción de cerveza tipo¿ lager¿ evolucionada para dar lugar a una baja producción de diacetilo; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen ILV5 que codifica para una isomerorreductasa que convierte el ¿-acetolactato en ¿-ß-dihidroxivalerato. De esta forma, se evita la acumulación de ¿-acetolactato en la cerveza y se acorta sensiblemente el proceso de maduración al haberse reducido la producción de diacetilo. La cepa evolucionada consigue disminuir en más de 10 días con respecto a la cepa parental el tiempo necesario para que la concentración de diacetilo esté al nivel que la práctica industrial considera aceptable para dar por finalizado el proceso de ¿lagering¿. b) Una levadura en la que se ha aumentado notablemente su actividad pectinolítica, lo que presenta aplicaciones para su uso en el procesado industrial de material vegetal rico en pectina; y en la que el fenotipo buscado se ha obtenido mediante la sobreexpresión del gen PGU1 que codifica para una endopoligalacturonasa. Se obtuvieron dos nuevas variantes de la cepa parental, una conteniendo el casete de selección y otra en la que dicho casete se eliminó mediante un proceso denominado ¿pop out¿, permitiendo de esta forma la reutilización de dicho casete en sucesivos diseños de reordenación genómica sobre la misma cepa. Ambas variantes presentan un notable incremento de la actividad hidrolítica sobre la pectina sin perjuicio de su producción de etanol ni de su capacidad fermentativa. c) Una levadura vínica comercial que se ha evolucionado en busca de una mejor tolerancia frente a bajas temperaturas. Se ha intentado obtener el fenotipo deseado mediante inactivación del gen INP51 que codifica una enzima inositol polifosfato 5- fosfatasa, implicada en la homeostasis del inositol 4, 5-difosfato, cuya pérdida de función provoca la acumulación de dicho metabolito y, según se ha descrito en la literatura, un aumento de la tolerancia al frío. Se han obtenido nuevas cepas en las que se ha inactivado bien una copia del gen INP51 de la cepa industrial, bien ambas copias. Sin embargo, y contrariamente a lo descrito para la cepas de laboratorio, la inactivación del gen INP51 no aumenta la capacidad de crecimiento frente a bajas temperaturas de la cepa industrial evolucionada. Todos estos ejemplos de aplicación de la metodología desarrollada demuestran la utilidad del concepto de Evolución Genómica mediante Diseño Molecular en la mejora de las cepas de levaduras industriales del género SaccharomycesSani, D. (2013). Evolución genómica por diseño molecular de levaduras industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34325TESI

Untersuchungen zur Ammoniakleitfähigkeit von Aquaporinen

Ammonia is a molecule similar in size and polarity to water, yet its rate of permeation through water-selective aquaporins (AQP) is comparatively low. The amino acids lining the narrowest region of the water-selective rat AQP1, the so-called aromatic/arginine (ar/R) constriction, were altered by site-directed mutagenesis so as to resemble the corresponding region in the water- and ammonia-permeable human AQP8. The resulting AQP1 mutants were tested for water permeability by osmotic assays with Xenopus laevis oocytes and with protoplasts of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Permeability for ammonia and its analogue methylamine were tested with yeast growth assays. All AQP1 mutants retained water permeability to some degree, even the H180F mutant which is expected to have an ar/R constriction narrower than that of the wild-type channel. Ammonia- and methylamine permeability was found in those AQP1 mutants which had an alanine or isoleucine in place of Histidine 180, the latter being the corresponding amino acid in AQP8. In the case of ammonia, leucine was also permissible. Human and rat AQP8 mutants with histidine in place of Isoleucine 198 and 200, respectively, retained water permeability. Their ammonia and methylamine permeability could not be studied by yeast growth assays. The ammonia influx assay makes use of a yeast strain lacking its ammonium transporters Mep1-3 as well as its ammonia-permeable aquaglyceroporin Fps1. It was found to indicate elevated ammonia tolerance at neutral or mildly alkaline pH, rather than facilitated influx of ammonia as nitrogen source. In addition, replacing ammonium ions by amino acids such as glutamine did not completely abolish this pH-dependent effect. The methylamine efflux assay makes use of a yeast strain lacking its aquaglyceroporin Fps1 which would otherwise allow accumulated toxic methylamine to escape from the cell. It was found to indicate increased tolerance of yeast to pH 6.5 and 7.5, even in the absence of methylammonium in the growth medium. Yeast growth assays and osmotic assays with yeast protoplasts and human erythrocytes were employed for the study of potential inhibitors of human AQP1, AQP9, and of Plas-modium falciparum AQP. The substances had been discovered by collaborators using in silico high-throughput screening. No test compound was found to be active. Inhibition of human AQP1 by mercuric chloride, and of human AQP9 by mercuric chloride and phloretin, was confirmed.Das Ammoniakmolekül ähnelt dem Wassermolekül hinsichtlich seiner Größe und seiner Polarität. Trotzdem ist seine Permeationsrate durch wasserselektive Aquaporine (AQP) ver-hältnismäßig gering. Die aromatische/Arginin (ar/R)-Konstriktion des wasserselektiven AQP1 der Ratte, wurde durch einzelne sowie durch mehrfache gezielte Punktmutationen von Aminosäuren so geän-dert, dass sie der ar/R-Konstriktion des Wasser und Ammoniak leitenden AQP8 ähnelte. Die erhaltenen AQP1-Mutanten wurden in osmotischen Tests mit Xenopus laevis Oozyten und Protoplasten der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae auf ihre Wasserleitfähigkeit hin untersucht. Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden in Hefewachstumstests geprüft. Alle AQP1-Mutanten wiesen Wasserleitfähigkeit auf, sogar AQP1 H180F, dessen ar/R-Kon-striktion wahrscheinlich schmaler ist als die des Wildtypkanals. Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden festgestellt für AQP1-Mutanten in denen Histidin 180 durch Alanin oder Isoleucin ausgetauscht worden ist. Bezüglich der Ammoniak-leitfähigkeit war Leucin an dieser Stelle ebenfalls einsetzbar. Die Wasserleitfähigkeit des AQP8 des Menschen und der Ratte blieb nach Austausch von Isoleucin 198 bzw. Isoleucin 200 durch Histidin bestehen. Ihre Ammoniak- und Methylamin-leitfähigkeit konnte mittels Hefewachstumstests nicht überprüft werden. Der Ammoniakinfluxtest bedient sich eines Hefestammes welchem die Ammoniumtrans-porter Mep1-3 und das Ammoniak leitende Aquaglyceroporin Fps1 fehlen. Er zeigte eine durch heterologe AQP erhöhte Ammoniaktoleranz bei neutralem oder leicht alkalischem pH an, nicht jedoch den erleichterten Einstrom von Ammoniak als Stickstoffquelle. Außerdem konnte der Austausch von Ammoniumionen durch Aminosäuren, z. B. Glutamin, diesen pH-abhängigen Effekt nicht vollständig eliminieren. Der Methylamineffluxtest bedient sich eines Hefestammes dem das Aquaglyceroporin Fps1 fehlt, welches ansonsten den Ausstrom von aufgenommenem, toxischem, Methylamin ermöglichen würde. Er zeigte eine zusätzliche methylaminunabhängige AQP-vermittelte Toleranz der Hefe gegenüber pH Werten von 6,5 und 7,5 an. Hefewachstumstests und osmotische Tests mit Hefeprotoplasten und humanen Erythro-cyten wurden zur Untersuchung von potentiellen Inhibitoren der humanen Aquaporine AQP1 und AQP9, sowie des Plasmodium falciparum AQP, verwendet. Die Testsubstanzen waren von Kooperationspartnern mittels in silico Hochdurchsatz-Screening gefunden worden. Keine der Substanzen zeigte Aktivität. Die Blockierung von menschlichem AQP1 durch Queck-silber(II)chlorid, sowie von menschlichem AQP9 durch Quecksilber(II)chlorid und Phloretin, konnte bestätigt werden