Mfd Affects Global Transcription and the Physiology of Stressed Bacillus subtilis Cells

© Copyright © 2021 Martin, Sundararajan, Ermi, Heron, Gonzales, Lee, Anguiano-Mendez, Schilkey, Pedraza-Reyes and Robleto. For several decades, Mfd has been studied as the bacterial transcription-coupled repair factor. However, recent observations indicate that this factor influences cell functions beyond DNA repair. Our lab recently described a role for Mfd in disulfide stress that was independent of its function in nucleotide excision repair and base excision repair. Because reports showed that Mfd influenced transcription of single genes, we investigated the global differences in transcription in wild-type and mfd mutant growth-limited cells in the presence and absence of diamide. Surprisingly, we found 1,997 genes differentially expressed in Mfd– cells in the absence of diamide. Using gene knockouts, we investigated the effect of genetic interactions between Mfd and the genes in its regulon on the response to disulfide stress. Interestingly, we found that Mfd interactions were complex and identified additive, epistatic, and suppressor effects in the response to disulfide stress. Pathway enrichment analysis of our RNASeq assay indicated that major biological functions, including translation, endospore formation, pyrimidine metabolism, and motility, were affected by the loss of Mfd. Further, our RNASeq findings correlated with phenotypic changes in growth in minimal media, motility, and sensitivity to antibiotics that target the cell envelope, transcription, and DNA replication. Our results suggest that Mfd has profound effects on the modulation of the transcriptome and on bacterial physiology, particularly in cells experiencing nutritional and oxidative stress

Sequence and structural investigation of the nonribosomal peptide synthetases of Bacillus atrophaeus UCMB 5137(63Z)

Due to increased plant resistance to the existing antibiotics produced, there is a need to develop alternatives. Nonribosomal peptides (NRPs) are important plant phytopathogens synthesized by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). In this study, a newly sequenced Bacillus strain Bacillus atrophaeus UCMB 5137 (63Z), found to have increased phytopathogenic activity, was investigated to gain insights to the possible reason behind this activity. NRPS modules were identified using a novel script that can act on unannotated, raw DNA sequences. The Structure Based Sequence Analysis Webserver was used to identify the amino acids incorporated into the final NRP, which were compared to the NRP database. Five NRPSs were found within the strain; fengycin/plipstatin, mycosubtilin, surfactin, bacillibactin and bacitracin. Some of the modules usually present for these NRPSs were not present in the test strain and only a few modules were found. A phylogenetic study was carried out and the topologies of the trees showed that genes were not transferred horizontally. It did, however, lead to the hypothesis that different NRPS genes are under different adaptive evolutionary pressures. Only slight conformational changes between L and D-conformation of amino acids were seen between the test and neighboring strains. All of the linker and terminal regions of synthetases were found to exhibit a large amount of conservation overall. Homology modeling was performed on the test strain on selected modules, TE and A-domains of fengycin and mycosubtilin synthetases. TE-domains between the different synthetases are different and specific for the NRP they facilitate release for. The NRPS from which the A-domain originates also influences substrate specificity as well as the module in which the A-domain occurs within the NRPS. Binding pockets of A-domains of differing substrate specificity were compared. Future work will include; refinement of the models and docking studies within the A-domain binding pocket.Microsoft� Word 2010Adobe Acrobat 9.54 Paper Capture Plug-i

Mechanismen der C-Domänen-vermittelten Lipoinitiation in der nichtribosomalen Peptidsynthese

Nichtribosomal synthetisierte Lipopeptide aus mikrobiellen Organismen weisen ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten auf, zu denen beispielsweise antibiotische, antitumorale aber auch biotensidische Eigenschaften zählen. Daher sind diese Naturstoffe von pharmazeutischem sowie biotechnologischem Interesse und stellen einen Gegenstand intensiver gegenwärtiger Forschung dar. Die Biosynthese dieser Lipopeptide beginnt in der Regel mit der Inkorporation des Fettsäurerestes, die durch eine N-Acylierung des Peptidrückgrats stattfindet und als Lipoinitiation bezeichnet wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung verschiedener Lipoinitiationsmechanismen, zu denen die Aktivierung und die Übertragung des Fettsäurerests gehört. In den Biosynthesewegen des Lipoheptapeptids Surfactin aus Bacillus subtilis und des sauren Lipodepsipeptids CDA (engl.: calcium-dependent antibiotic) aus Streptomyces coelicolor A3(2) konnten diese Reaktionen biochemisch charakterisiert werden. Diese stellen zwei neue Strategien der Lipoinitiation dar. Dazu wurden die beteiligten Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) heterolog als singuläre Proteine produziert und die Substrate, sofern nötig, chemisch synthetisiert. In den biochemischen Untersuchungen zeigte sich, dass in beiden Reaktionen die Kondensations(C)-Domäne des Initiationsmoduls der jeweiligen Peptidsynthetase als Acyltransferase wirkt und für den Transfer der Fettsäure essentiell ist. Die Notwendigkeit des aus anderen C-Domänen bekannten katalytisch aktiven Motivs HHxxxDG konnte durch Mutationsstudien in den hier untersuchten Initiations-C‑Domänen bestätigt werden und deutet auf einen universellen Katalysemechanismus der Familie der C‑Domänen hin. Die beiden untersuchten Systeme der Lipoinitiation der Surfactin- und CDA-Biosynthese zeigten jedoch auch Unterschiede. Während in der Surfactinsynthese eine durch Enzyme aus dem Primärmetabolismus CoA-aktivierte Fettsäure mit der Peptidyl-Carrier-Protein(PCP)-gebundenen Aminosäure kondensiert wird, wird die Fettsäure in der CDA-Biosynthese von einem Acyl-Carrier-Protein ausgehend übertragen. In beiden Reaktionen zeigten sich ausgeprägte Spezifitäten mit Ausnahme der Selektivität für die PCP‑Domäne, die in beiden Systemen durch fremde PCP-Domänen substituiert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit bestand aus der Charakterisierung der eng mit C-Domänen verwandten Zyklisierungs-Domäne aus der Bacitracin-Synthetase BacA-Cy2. Diese katalysiert die Bildung des Thiazolinrings in dem Antibiotikum Bacitracin aus Bacillus licheniformis und wurde in dieser Arbeit ebenfalls als freistehendes Protein heterolog produziert, wodurch eine genaue Charakterisierung und Bestimmung der ausgeprägten Substratspezifität ermöglicht wurde

Functional genome analysis of the plant-growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42

Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein im Boden weit verbreitetes Bakterium. Es kolonisiert Pflanzenwurzeln und werde als Biodünger verwendet, da sie in der Lage sind, Pflanzenwachstum zu fördern. Der domestizierte Stamm B. subtilis 168 ist eng verwand mit B. amyloliquefaciens FZB42, fördert jedoch kein Pflanzenwachstum. Als ein erster Ansatz zur Ermittlung von Gendifferenzen zwischen FZB42 und B. subtilis 168 - wobei zum damaligen Zeitpunkt nur die Genomsequenz letzteren Organismus bekannt war - wurde die Supression Subtractive Hybridisation (SSH) angewandt. Hierdurch wurden mehrere einzigartige Gene in B. amyloliquefaziens identifiziert. Unterdessen beteiligte sich unser Labor in Kollaboration mit dem GenoMik Network in Göttingen an einem Projekt, dessen Ziel die komplette Sequenzierung des Genoms von B. amyloliquefaciens war. Der Hauptanteil der Arbeit, sowie die Koordination des gesamten Projekts wurden von Xiao-Hua Chen und mir selbst durchgeführt. B. amyloliquefaciens FZB42 besitzt die srf, fen, pks1 (bae), bac und dhb Operons, welche für die Synthese von Surfactin, Fengycin, Bacillaene, Bacilysin und Bacillibactin verantwortlich sind und die ebenfalls im Genom von B. subtilis 168 enthalten sind. Das Genom von B. amyloliquefaciens FZB42, beinhaltet die bmy Gencluster, die die Synthese von Bacillomycin D kontrolliert. Ein weiteres in dieser Arbeit verfolgtes Ziel war die Identifizierung der regulatorischen Wege, die die Expression von Bacillomycin D steuern. Es wurde gezeigt, dass globale Regulatoren, wie beispielsweise DegU, DegQ und ComA, die alternativen Sigmafaktoren sigB und sigH und ein neuartiges Rap-Protein die transkriptionale Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten Hauptpromotors des bmy-Operons beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass DegU seine Effekte nach direkter Bindung an zwei unterschiedliche Regionen im bmy-Promotor ausübt. Es wurde außerdem gezeigt, dass DegU abgesehen von der Aktivierung des Hauptpromoters des bmy-Operons eine zusätzliche, vermutlich eine post-transkriptionale Rolle spielt. Auf ähnliche Weise erwies sich YczE, ein Membranprotein unbekannter Funktion, das neben sfp kodiert liegt, als essentiell für die Bacillomycin D-Produktion. Der Effekt wurde auf einem post-transkriptionalen Level ausgeübt und war unabhängig von DegU.Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is widely distributed in the soil. It colonizes the plant roots and is used as bio-fertilizer, since they can promote plant growth.The domesticated strain of B. subtilis 168 is closely related to B. amyloliquefaciens FZB42, but does not promote plant growth. As a first approach to detect gene differentiation between FZB42 and B. subtilis 168, and since only the genome sequence of the latter was known at that point, Suppression Subtractive Hybridization (SSH) was employed. Thereby, several unique genes of B. amyloliquefaciens FZB42 could be identified. Meanwhile, our laboratory became engaged in a project aiming to define the complete genome sequence of B. amyloliquefaciens FZB42, in collaboration with the GenoMik Network in Göttingen. The major part of the work and the co-ordination of the whole process were performed by Xiao-Hua Chen and myself. B. amyloliquefaciens FZB42 possesses the srf, fen, pks1 (bae), bac and dhb operons, which are also shared by B. subtilis 168. In addition, the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 contains the bmy gene clusters, which controls the synthesis of bacillomycin D. A further issue pursued in this work was to identify the regulatory pathways that govern the expression of bacillomycin D. Global regulators, such as DegU, DegQ and ComA, the alternative sigma factors, sigB and sigH, and a novel Rap protein were found to affect the transcriptional activation of the main promoter of the bmy operon identified in this work. In particular, DegU was shown to mediate its effects, after binding directly to two sites at the bmy promoter region. DegU was shown to play an additional role on bacillomycin D production, presumably a post-transcriptional one. Similarly, YczE, a membrane protein of unknown function, encoded adjacently to sfp proved to be essential for bacillomycin D production, but dispensable for the production of the rest peptide antibiotics produced by B. amyloliquefaciens FZB42. The effect was mediated at a post-transcriptional level and was independent of DegU

Untersuchungen zur Lipoinitiation während der nichtribosomalen Synthese von Daptomycin und Surfactin

Die zyklischen Lipopeptid-Antibiotika stellen eine Klasse strukturell verwandter und bioaktiver Oligopeptide dar, welche durch multimodular aufgebaute Enzymkomplexe, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) assembliert werden. Essenziell für die antibiotische Aktivität ist die mit dem Peptidrückgrat verbundene Lipid-Einheit, welche einen einzigartigen Wirkmechanismus dieser Verbindungen ermöglicht. Die Modifikation dieser Fettsäure-Komponente ermöglicht somit die Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften der Lipopeptid-Antibiotika bezüglich der Bioaktivität, Stabilität sowie der Pharmakokinetik. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die mechanistische Aufklärung der Lipoinitiation des aziden Lipopeptids Daptomycin (Cubicin®) und des Biotensids Surfactin. Dazu sollten mittels bioinformatischer Methoden die für die Acylierung verantwortlichen Proteine identifiziert und in vivo und in vitro charakterisiert werden. Die bioinformatische Genomanalyse des Daptomycin Produzentenstammes Streptomyces roseosporus ermöglichte die Identifizierung der im Daptomycin Biosynthesegencluster codierten Acyl-CoA-Synthetase DptE und des Acyl-Carrier-Proteins (ACP) DptF als putative Lipidierungsmaschinerie. Zur in vitro Charakterisierung wurden diese Enzyme heterolog produziert, isoliert und auf ihre Aktivität und Substratspezifität hin untersucht. Hierbei zeigte sich, dass DptE eine hohe Substrattoleranz aufweist und diverse Fettsäuren als Adenylat aktiviert und auf das kognate ACP DptF transferiert. Kinetische Spezifitätsuntersuchungen bestätigten, dass DptE eine hohe Präferenz für Fettsäuren zeigt, welche auch im natürlichen Daptomycin-Komplex (A21978C-Faktoren) vorkommen. Die Analyse der Transferreaktion mit verschiedenen ACPs zeigte, dass DptE eine hohe Affinität gegenüber DptF aufweist. Im Gegensatz zu Daptomycin konnten im Biosynthesegencluster von Surfactin (Bacillus subtilis MR168) keine Acyl-CoA-Synthetasen identifiziert werden, welche β-Hydroxy-myristinsäure aktivieren und auf das Beladungsmodul (SrfA-M1) übertragen können. Die Analyse des annotierten B. subtilis Genoms zeigte vier putative Proteine (LcfA, YhfL, YhfT, YngI) mit Sequenzhomologien zu Acyl-CoA-Synthetasen, welche nicht im Surfactin-Operon codiert vorlagen. Zur biochemischen Charakterisierung wurden diese heterolog produziert, isoliert und biochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, dass LcfA und YhfL die native β-Hydroxy-myristinsäure als CoA-Thioester aktivieren, wohingegen YhfT das Substrat ausschließlich als Adenylat aktiviert. Die Generierung von lcfA-, yhfT- und yngI-Deletionsmutanten in B. subtilis bestätigten die Beteiligung der identifizierten Enzyme an der Acylierung von Surfactin. So führte die gleichzeitige Deletion der drei putativen Acyl-CoA-Synthetasen zu einer Reduktion der Surfactin-Produktion um 98%. Zukünftige Komplementierungsstudien werden eine detailliertere Analyse der Lipidierungs- und Initiierungsreaktion während der Surfactin-Assemblierung ermöglichen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Lipidierung der klinisch relevanten zyklischen Lipopeptide Daptomycin und Surfactin resultieren in der Postulierung zweier unterschiedlicher Acylierungsstrategien während der nichtribosomalen Synthese von Oligopeptiden. Die Umsetzung der hierdurch gewonnenen Erkenntnisse sollte in Zukunft die Generierung von Daptomycin- und Surfactin-Derivaten mit optimierter Bioaktivität durch metabolic engineering ermöglichen

Investigation of quorum sensing process in Bacillus licheniformis

Quorum sensing is a well-established system of communication adopted by a number of bacterial, and some fungal, populations. This cell density dependent phenomenon is based on the accumulation of small diffusible molecules, termed as quorum sensing molecules, in the extracellular milieu until a threshold concentration triggers alteration in the expression of specific genes culminating in variety of responses including virulence, bioluminescence, sporulation, biofilm formation and secondary metabolites production. In Bacilli, quorum sensing is mediated by small peptides that control competence, sporulation, and the production of certain secondary metabolites in a cell density dependent fashion. Two divergent pathways, triggered by the ComX pheromone and the Competence and Sporulation Factor (CSF), are engaged in the control of these processes. B. licheniformis NCIMB 8874 is a bacterium with industrial relevance for the production of the antimicrobial agent bacitracin. This organism is genetically related to Bacillus subtilis, whose quorum sensing is regulated by the comQXPA operon. This study aimed to investigate the role of the comQXPA locus in B. licheniformis NCIMB 8874 and the production of potential signalling molecules in this bacterium. Production of signalling molecule/s in B. licheniformis NCIMB 8874 was confirmed by the significant increase (p>0.05) in srfA expression in response to the addition of supernatants of B. licheniformis NCIMB 8874 cultures in their late exponential phase to low cell density cultures of B. subtilis reporter strains, carrying a srfA-lacZ fusion. The investigation of quorum sensing-regulated secondary metabolites production established production of lichenysin, -polyglutamic acid and extracellular proteases, whose biosynthesis is impaired in bacteria with disrupted comQXPA clusters. Bioinformatics studies on B. licheniformis NCIMB 8874 genome sequence confirmed the presence of essential quorum sensing-related genes, such as the comQXPA gene cluster, comK, mecA and comS. Moreover, in silico analysis allowed the identification of members of the Rap and Phr families, which aid the regulation of cell density dependent phenomena in B. subtilis. The results presented in this work positively indicate that B. licheniformis NCIMB 8874 cell-cell communication operates in analogy with the well established comQXPA-controlled pathway of B. subtilis.EThOS - Electronic Theses Online ServiceGBUnited Kingdo

Investigation of quorum sensing process in Bacillus licheniformis

Quorum sensing is a well-established system of communication adopted by a number of bacterial, and some fungal, populations. This cell density dependent phenomenon is based on the accumulation of small diffusible molecules, termed as quorum sensing molecules, in the extracellular milieu until a threshold concentration triggers alteration in the expression of specific genes culminating in variety of responses including virulence, bioluminescence, sporulation, biofilm formation and secondary metabolites production. In Bacilli, quorum sensing is mediated by small peptides that control competence, sporulation, and the production of certain secondary metabolites in a cell density dependent fashion. Two divergent pathways, triggered by the ComX pheromone and the Competence and Sporulation Factor (CSF), are engaged in the control of these processes. B. licheniformis NCIMB 8874 is a bacterium with industrial relevance for the production of the antimicrobial agent bacitracin. This organism is genetically related to Bacillus subtilis, whose quorum sensing is regulated by the comQXPA operon. This study aimed to investigate the role of the comQXPA locus in B. licheniformis NCIMB 8874 and the production of potential signalling molecules in this bacterium. Production of signalling molecule/s in B. licheniformis NCIMB 8874 was confirmed by the significant increase (p>0.05) in srfA expression in response to the addition of supernatants of B. licheniformis NCIMB 8874 cultures in their late exponential phase to low cell density cultures of B. subtilis reporter strains, carrying a srfA-lacZ fusion. The investigation of quorum sensing-regulated secondary metabolites production established production of lichenysin, -polyglutamic acid and extracellular proteases, whose biosynthesis is impaired in bacteria with disrupted comQXPA clusters. Bioinformatics studies on B. licheniformis NCIMB 8874 genome sequence confirmed the presence of essential quorum sensing-related genes, such as the comQXPA gene cluster, comK, mecA and comS. Moreover, in silico analysis allowed the identification of members of the Rap and Phr families, which aid the regulation of cell density dependent phenomena in B. subtilis. The results presented in this work positively indicate that B. licheniformis NCIMB 8874 cell-cell communication operates in analogy with the well established comQXPA-controlled pathway of B. subtilis