The functional role of mitochondria in neural progenitor cells

Neurodevelopment is a complex process that requires the precise spatiotemporal control of cellular differentiation. As cells differentiate, they undergo metabolic changes that make them increasingly reliant on their mitochondria for energy production. Beyond playing a central role in the bioenergetic support of newborn neurons, functional changes in mitochondria regulate the processes of cellular differentiation. Importantly, mitochondrial function extends beyond energy production. Mitochondria in neural stem cells play an essential role in both producing intermediates for biosynthesis and regulating calcium levels. In this thesis, I review the functional role of mitochondria in stem cell fate decisions, differentiation, and proliferation during neurodevelopment. Due to the challenges of directly measuring mitochondrial activity in vivo, I outline how genetically encoded fluorescent probes can be used to indirectly evaluate mitochondrial function. Beyond my review of this field, I engineered three genetically encoded fluorescent probes that can be used to measure both cytosolic and mitochondrial calcium activity in radial glial cells in Xenopus laevis. Preliminary imaging indicates the promising potential for these plasmids in the measurement of calcium activity and, by proxy, mitochondrial activity in differentiating stem cells

Loss of Wdfy3 in mice alters cerebral cortical neurogenesis reflecting aspects of the autism pathology.

Autism spectrum disorders (ASDs) are complex and heterogeneous developmental disabilities affecting an ever-increasing number of children worldwide. The diverse manifestations and complex, largely genetic aetiology of ASDs pose a major challenge to the identification of unifying neuropathological features. Here we describe the neurodevelopmental defects in mice that carry deleterious alleles of the Wdfy3 gene, recently recognized as causative in ASDs. Loss of Wdfy3 leads to a regionally enlarged cerebral cortex resembling early brain overgrowth described in many children on the autism spectrum. In addition, affected mouse mutants display migration defects of cortical projection neurons, a recognized cause of epilepsy, which is significantly comorbid with autism. Our analysis of affected mouse mutants defines an important role for Wdfy3 in regulating neural progenitor divisions and neural migration in the developing brain. Furthermore, Wdfy3 is essential for cerebral expansion and functional organization while its loss-of-function results in pathological changes characteristic of ASDs

Lineage tracing of early organogenesis and liver mesenchymal cells with ultrasound-guided in utero nano-injection

Current methods used to investigate embryo development and alter gene expression in mouse embryos are often time consuming and require large numbers of mice. To circumvent these limitations, we were aiming to develop a flexible and efficient method to investigate embryo development and manipulate gene expression in utero. Two tissues of interest to target in vivo are the ectodermal/ neural compartment, and mesoderm. Neurectoderm gives rise to the brain, spinal cord and peripheral nervous system, among others, while mesoderm gives rise to blood, muscle, and mesenchymal cells, among other cell types. Mesenchymal cells in liver, including peri-portal fibroblasts, mesothelial cells and hepatic stellate cells (HSCs), play multiple crucial roles in normal liver development, liver regeneration or liver fibrosis when liver is injured. Mesenchymal cells express both neural and mesenchymal markers, therefore both a neural crest (NC) and mesoderm origin have been proposed. The embryonic origin of HSCs is a long-debated topic in this field due to the lack of specific marker genes and potential convergent differentiation from different origins. To investigate nervous system development, we first hypothesized that by injecting lentivirus into the amniotic cavity (AC) prior to the neural plate closure, the open neural plate should be labeled and therefore label the future brain and spinal cord. In Paper I and II, we developed NEPTUNE (NEural Plate Targeting by in Utero NanoinjEction) to transduce either nervous system with up to 99% efficacy or selectively achieve the expression in specific cell types by using cell-specific MiniPromoters. In Paper III, the first aim was to develop a method to target mesoderm, and then to apply this technology to investigate liver mesenchymal cells. We hypothesized that exclusive labeling of the mesoderm and its progeny could be achieved by injecting into the exocoelomic cavity (ExC) during gastrulation after the segregation of three germ layers and full establishment of two cavities (AC and ExC), since mesoderm is in contact with the ExC. Therefore, we further adapted ultrasound-guided in utero nano-injection to lineage trace mesoderm descendants by injecting a diverse lentivirus barcode library into the ExC at embryonic day (E)7.5. In parallel, we used NEPTUNE, to target ectoderm/neural crest as well as primitive streak (PS) by injecting into AC at E7.5. Embryos were collected at E9.5 and E10.5 to address early organogenesis and the origin of septum transversum mesenchyme (STM), a transit tissue believed to contribute to the mesenchymal compartments of diverse internal organs. E16.5 livers were collected to resolve the clonal relations between different mesenchymal cells in the liver. In summary, during my doctoral studies, we developed two new approaches to target embryonic tissues during development. Ultrasound-guided in utero nano-injection is a flexible and efficient tool to elucidate clonal relations among tissues in early mouse embryo development, as well as for gene manipulation. It significantly minimizes both the financial cost and ethical burdens associated with animal research, in the meantime accelerating the progression from hypothesis to in vivo results

Tissue Mechanics Regulate Mitotic Nuclear Dynamics during Epithelial Development.

Cell divisions are essential for tissue growth. In pseudostratified epithelia, where nuclei are staggered across the tissue, each nucleus migrates apically before undergoing mitosis. Successful apical nuclear migration is critical for planar-orientated cell divisions in densely packed epithelia. Most previous investigations have focused on the local cellular mechanisms controlling nuclear migration. Inter-species and inter-organ comparisons of different pseudostratified epithelia suggest global tissue architecture may influence nuclear dynamics, but the underlying mechanisms remain elusive. Here, we use the developing Drosophila wing disc to systematically investigate, in a single epithelial type, how changes in tissue architecture during growth influence mitotic nuclear migration. We observe distinct nuclear dynamics at discrete developmental stages, as epithelial morphology changes. We use genetic and physical perturbations to show a direct effect of cell density on mitotic nuclear positioning. We find Rho kinase and Diaphanous, which facilitate mitotic cell rounding in confined cell conditions, are essential for efficient apical nuclear movement. Perturbation of Diaphanous causes increasing defects in apical nuclear migration as the tissue grows and cell density increases, and these defects can be reversed by acute physical reduction of cell density. Our findings reveal how the mechanical environment imposed on cells within a tissue alters the molecular and cellular mechanisms adopted by single cells for mitosis

Monitoring the activity of the Notch pathway in neural progenitor cells

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neural progenitor (NP) cells proliferate in the ventricular zone (VZ) of the neural tube and migrate towards the mantle layer (ML) upon neural differentiation. In order to produce the correct type and number of neurons at the right time, a precise control of the proliferation of neural progenitor (NP) cells and their differentiation is required. The Notch signaling pathway, through lateral inhibition, is involved in this balance, restraining NP differentiation. However, not much is known about Notch activity in single NPs, mainly regarding possible variations on Notch activity in each NP, and how this putative dynamic activity contributes to the maintenance of these cells in the undifferentiated state. In order to answer these questions, I used several ES cell lines expressing different reporters of Notch activity driven by the promoter of the Hes5 gene. These ES cells can be directed to neural differentiation in adherent monolayer cultures, resulting in the production of neuroepithelial rosettes that mimic their in vivo counterpart, the neural tube. Here, I show that an already described Hes5::GFP reporter ES cell line is not suitable to be used as a reporter of Notch activity since the half-life of the reporter protein is much longer than that of the HES5 protein, not allowing the detection of the termination of Notch activity. I also test other ES cell lines, Hes5::VNP, that express an unstable reporter protein, which might allow a more precise and accurate monitoring of Notch activity dynamics. Using this cell lines, I could observe that not all cells in neuroepithelial rosettes express the reporter protein, and that the levels of Notch activity are variable between NPs. Further engineering of these cell lines needs to be performed in order to be able to construct a double reporter cell line carrying a reporter of Notch activity together with a reporter of neuronal differentiation to allow visualization of differentiated neurons.O tubo neural, estrutura embrionária que no adulto origina o sistema nervoso central, encontra-se organizado em duas zonas: a zona ventricular, onde residem os progenitores neurais, e a zona do manto, para onde migram estas células quando começam a diferenciar em neurónios. Os núcleos dos progenitores neurais movimentam-se entre as regiões apical e basal da zona ventricular num mecanismo designado de movimento intercinético nuclear. Este movimento encontra-se relacionado com as fases do ciclo celular, sendo que a mitose ocorre quando o núcleo dos progenitores neurais se encontra na região apical e a fase S quando este se encontra na região basal. Durante a neurogénese é necessária a existência de um controlo preciso entre a manutenção de células num estado indiferenciado e a diferenciação destes progenitores em células neurais. Sabe-se que a via de sinalização Notch está implicada neste balanço através do processo de inibição lateral, restringindo a diferenciação das células progenitoras. Inicialmente todas as células expressam níveis semelhantes de ligandos Notch e genes pró-neurais. Contudo, devido a variações estocásticas, uma das células começa a expressar níveis mais elevados de ligandos Notch e consequentemente é mais eficiente na activação de Notch nas células vizinhas. Nas células em que Notch é activado há expressão de genes Hes que reprimem a expressão de genes pró-neurais e levam à consequente manutenção dessas células como progenitores neurais. Por sua vez, nas células que não activaram Notch ocorre a expressão de genes pró-neurais com consequente diferenciação dos progenitores neurais. Após a migração dos neurónios nascentes para a zona do manto, estas células deixam de sinalizar para as células adjacentes. Desta forma a actividade de Notch diminui nos progenitores neurais vizinhos e o processo de inibição lateral poderá ser reiniciado. Assim, os níveis de Notch em progenitores neurais não deverão ser constantes e a sinalização Notch será dinâmica. A actividade dinâmica da via de sinalização Notch foi monitorizada na mesoderme pré-somítica e em culturas de progenitores neurais isolados utilizando uma proteína reporter instável sob o controlo do promotor de um gene alvo de Notch: Hes1. A utilização deste repórter permitiu observar variações na expressão de Hes1. Contudo, foi observado que a expressão de Hes1 não é apenas dependente da actividade da via Notch, respondendo a outras vias de sinalização como a via Jak/Stat, o que impossibilita a monitorização apenas da actividade da via de sinalização Notch. Uma outra observação concordante com a actividade dinâmica de Notch é a expressão de componentes da via Notch em gradientes entre as regiões apical e basal da zona ventricular, sugerindo que nos progenitores neurais a activação de Notch é específica de determinadas fases do ciclo celular. Em retina de peixe zebra foi observado que o receptor Notch activado é expresso em níveis elevados na região apical, onde os progenitores se encontram nas fases G2/M/G1 do ciclo celular. Contudo, em cérebro de ratinho o receptor Notch activado foi detectado em células em fase S do ciclo celular e não em mitose. No tubo neural de galinha o mRNA de Notch foi detectado na região apical da zona ventricular, onde ocorre a mitose. Estes resultados contraditórios podem indicar regulações diferentes da actividade Notch em diferentes organismos e tecidos. Desta forma, uma análise mais profunda é necessária para determinar se a activação de Notch ocorre especificamente em determinadas fases do ciclo celular. Por outro lado é necessária a análise de progenitores neurais ao nível de células individuais recorrendo a um repórter que responda apenas a Notch. Apenas desta forma será possível determinar se Notch pode ser activado mais do que uma vez no tempo de vida de cada progenitor neural e se a sua actividade é necessária para manter estes progenitores neurais num estado indiferenciado. Neste trabalho utilizaram-se várias linhas celulares de células estaminais embrionárias (Hes5::GFP and Hes5::VNP) que expressam diferentes proteínas repórter sob o controlo do promotor do gene Hes5, que se pensa ser o principal alvo da via Notch no sistema nervoso central. Estas células estaminais embrionárias podem ser diferenciadas em tecido neural, através de um protocolo de cultura de células aderentes em monocamada, formando estruturas características designadas rosetas neuroepiteliais, onde a expressão de Hes5 foi já documentada. A linha celular Hes5::GFP já tinha sido descrita e foi testada relativamente às suas capacidades de auto-renovação e pluripotência tendo-se observado que não diferia da linha celular controlo. Adicionalmente, a sua capacidade de diferenciação neural e a expressão da proteína repórter foram testadas tendo-se confirmado a capacidade de originar rosetas neuroepiteliais em que a expressão da proteína repórter estava presente. O tempo de semi-vida da proteína repórter foi determinado de forma a avaliar se esta linha celular iria permitir a monitorização e determinação do início e terminação da actividade da via Notch. Observou-se que 12 horas após o bloqueio da tradução as células ainda exprimem cerca de 75% do valor inicial de proteína repórter GFP. Dado que o tempo de semi-vida da proteína HES5 é de aproximadamente 1 hora foi possível concluir que esta linha repórter não pode ser usada para monitorizar a actividade Notch uma vez que permanece nas células durante muito tempo após a sua terminação. Foram geradas no Laboratório linhas celulares que expressam uma proteína repórter instável sob controlo do promotor do gene Hes5 de forma a possibilitar a detecção do começo e terminação da actividade Notch. Estas linhas foram validadas em termos de capacidade de auto-renovação e pluripotência tendo-se observado que as suas características não diferiam daquelas da linha celular controlo. Adicionalmente, foi confirmada a capacidade de formação de rosetas neuroepiteliais e expressão da proteína repórter. Das linhas geradas a linha Hd foi escolhida para continuar as experiências tendo-se observado que a intensidade de expressão do repórter não é igual em todas as células das rosetas originadas por estas células. Este resultado sugere que a intensidade da actividade Notch varia entre os progenitores neurais. Este facto pode ser explicado pelo facto de a expressão de Notch ser constante em cada célula mas variar entre diferentes células, ou pelo facto de esta expressão ter variações na mesma célula. De realçar ainda que estes resultados sugerem possíveis flutuações na actividade da via Notch, enfatizando a importância da monitorização de Notch ao nível de um único progenitor neural. A linha celular Hd, possui a sequência do gene de resistência à Neomicina localizada entre a região codificante da proteína VNP e a região 3‟UTR do gene Hes5, onde se localiza o sinal de poli-adenilação necessário para a produção de um transcrito com todos os sinais de regulação pós-transcricional necessários. Desta forma procedeu-se à remoção do gene de resistência à Neomicina de forma a assegurar a correcta expressão da proteína repórter. Contudo, nas linhas celulares obtidas após este procedimento não se observou expressão da proteína reporter. Após vários testes à sequência promotora e à expressão do repórter ao nível de mRNA e proteína concluiu-se que a falta de expressão do repórter deveria dever-se a problemas a nível da transcrição. De forma a ultrapassar estes constrangimentos novas linhas celulares deverão ser desenhadas e geradas de forma a que o cDNA da proteína reporter possua o seu próprio sinal de poliadenilação antes de se proceder à remoção da cassete de selecção. Desta forma a expressão da proteína repórter poderia ser analisada imediatamente aquando da geração das linhas sem serem necessários procedimentos adicionais de remoção da cassette de selecção, que acarretam a possibilidade de introdução de instabilidade genómica e danos no DNA. Após a construção de linhas Hes5::VNP capazes de monitorizar de forma fiel a actividade da via Notch será possível monitorizar esta actividade em progenitores neurais ao nível de células individuais. Assim será possível determinar se Notch pode ser activado várias vezes ao longo do tempo de vida destas células e especificamente em determinadas fases do ciclo celular e se essa activação está correlacionada com a manutenção das células num estado indiferenciado. Adicionalmente, estas linhas celulares podem ser usadas para a formação de uma dupla linha repórter que expressa repórteres da actividade Notch e também de diferenciação. Desta forma será possível avaliar não só as variações na actividade da via Notch mas também diferenciação neuronal, correlacionando a actividade Notch com o destino celular dos progenitores neurais

Exosomes regulate neurogenesis and circuit assembly.

Exosomes are thought to be released by all cells in the body and to be involved in intercellular communication. We tested whether neural exosomes can regulate the development of neural circuits. We show that exosome treatment increases proliferation in developing neural cultures and in vivo in dentate gyrus of P4 mouse brain. We compared the protein cargo and signaling bioactivity of exosomes released by hiPSC-derived neural cultures lacking MECP2, a model of the neurodevelopmental disorder Rett syndrome, with exosomes released by isogenic rescue control neural cultures. Quantitative proteomic analysis indicates that control exosomes contain multiple functional signaling networks known to be important for neuronal circuit development. Treating MECP2-knockdown human primary neural cultures with control exosomes rescues deficits in neuronal proliferation, differentiation, synaptogenesis, and synchronized firing, whereas exosomes from MECP2-deficient hiPSC neural cultures lack this capability. These data indicate that exosomes carry signaling information required to regulate neural circuit development