Structural Characterization of Serine Protease Complexes with Novel Inhibitors

Human Neutrophil Elastase (HNE) is a serine protease responsible for cleavage of peptide bonds conferring elasticity to the connecting tissues. For this reason, this enzyme is mainly found in the lungs, arteries and ligaments [1-2]. In case of over-expression, HNE enables the appearance of some diseases, such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD), Rheumatoid Arthritis, Psoriasis and Arteriosclerosis [3-4]. Currently, diseases affecting the respiratory tract are one of the major causes of death in the world, so HNE is a potential drug target of considerable interest [4]. Porcine Pancreatic Elastase (PPE) is commonly used as a model for HNE, sharing 37% of amino acid sequence identity [5]. According to previous studies, the catalytic serine performs a nucleophilic attack on a carbonyl group present in the inhibitors [6]. The focus of this work was the three-dimensional structure determination of elastases (PPE and HNE) in complex with inhibitors by X-ray crystallography to characterize their interactions at atomic level. The rational is to correlate structure and function and contribute to the design of more potent and specific inhibitors. These newly synthetic compounds were provided by the group of Prof. Rui Moreira, Instituto de Investigação do Medicamento, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa. X-ray diffraction data of PPE crystals were collected at a synchrotron source and three 3D-structures of PPE in complex with inhibitors were determined at resolutions around 1.4 Ǻ. Analysis of the electron density maps revealed that the nucleophilic attack occurred at the sulfonyl group of the inhibitors, contrary to what was initially expected (which would be in the carbonyl group). In silico energy minimization studies of the docked ligand structure into the active site of HNE, show no relevant structural modifications of the protein structure upon ligand binding. Finally, crystals of HNE have already been obtained and experiments are ongoing to grow complexes of HNE with various inhibitors. References: [1] A. Thomson and S. B. Kapadia, “The specificity of the S1 and S2 subsites of elastase,” Eur. J. Biochem., vol. 102, pp. 111–116, 1979. [2] Z. Werb, M. J. Banda, J. H. McKerrow, and R. A. Sandhaus, “Elastases and elastin degradation.,” J. Invest. Dermatol., vol. 79 Suppl 1, p. 154s–159s, Jul. 1982. [3] E. F. P. Ruivo, L. M. Gonåalves, L. A. R. Carvalho, R. C. Guedes, S. Hofbauer, J. A. Brito, M. Archer, R. Moreira, and S. D. Lucas, “Clickable 4-Oxo- b -lactam-Based Selective Probing for Human Neutrophil Elastase Related Proteomes,” pp. 1–7, 2016. [4] L. R. P. Areias, E. F. P. Ruivo, M. T. Duarte, R. Moreira, S. D. Lucas, and R. C. Guedes, “RSC Advances PAPER A uni fi ed approach toward the rational design of selective low nanomolar human neutrophil elastase,” pp. 51717–51721, 2015. [5] “Uniprot.” [Online]. Available: http://www.uniprot.org/. [Accessed: 16-Aug-2017]. [6] W. Huang, Y. Yamamoto, Y. Li, D. Dou, K. R. Alliston, R. P. Hanzlik, T. D. Williams, and W. C. Groutas, “X-ray Snapshot of the Mechanism of Inactivation of Human Neutrophil Elastase by 1,2,5-Thiadiazolidin-3-one 1,1-Dioxide Derivatives.,” Society, pp. 2003–2008, 2008.Elastase Neutrófila Humana (HNE) é uma protease de serina responsável pela clivagem das ligações peptídicas que conferem elasticidade aos tecidos de conexão. Por esta razão, esta enzima é encontrada principalmente nos pulmões, artérias e ligamentos [1-2]. Em casos de sobre-expressão, esta permite o aparecimento de algumas doenças, como Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC), Artrite Reumatóide, Psoríase e Arteriosclerose [3-4]. Atualmente, as doenças que afetam o trato respiratório são uma das principais causas de morte no mundo, sendo então a HNE um potencial alvo terapêutico de considerável interesse [4]. A Elastase Pancreática Suína (PPE) é normalmente usada como modelo para HNE, compartilhando 37% de identidade de sequência primária [5]. De acordo com estudos anteriores, a serina catalítica realiza um ataque nucleofílico ao grupo carbonilo presente nos inibidores [6]. O foco deste trabalho foi a determinação por cristalografia de raios-X da estrutura tridimensional de elastases (HNE e PPE) complexadas com inibidores, de modo a caracterizar as respetivas interações a nível atómico. O racional é correlacionar a estrutura com a função e contribuir para o desenho de inibidores mais fortes e mais específicos. Estes novos compostos sintéticos foram fornecidos pelo grupo do Prof. Rui Moreira, Instituto de Investigação do Medicamento, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa. Os dados de difração de raios-X dos cristais de PPE foram recolhidos numa fonte de sincrotrão e três estruturas 3D de três complexos da PPE com inibidores foram determinadas com resoluções em torno dos 1,4 Å. A análise dos mapas de densidade eletrónica revelaram que o ataque nucleofílico ocorreu no grupo sulfonilo dos inibidores ao contrário do que era inicialmente esperado (que seria no grupo carbonilo). A minimização de energia in silico da estrutura do ligando acoplado no centro ativo da HNE não mostra modificações relevantes na estrutura da proteína após a ligação do ligando. Finalmente, já foram obtidos cristais de HNE, estando já em curso experiencias para o crescimento de cristais de complexos de HNE com vários inibidores. Referências: [1] A. Thomson and S. B. Kapadia, “The specificity of the S1 and S2 subsites of elastase,” Eur. J. Biochem., vol. 102, pp. 111–116, 1979. [2] Z. Werb, M. J. Banda, J. H. McKerrow, and R. A. Sandhaus, “Elastases and elastin degradation.,” J. Invest. Dermatol., vol. 79 Suppl 1, p. 154s–159s, Jul. 1982. [3] E. F. P. Ruivo, L. M. Gonåalves, L. A. R. Carvalho, R. C. Guedes, S. Hofbauer, J. A. Brito, M. Archer, R. Moreira, and S. D. Lucas, “Clickable 4-Oxo- b -lactam-Based Selective Probing for Human Neutrophil Elastase Related Proteomes,” pp. 1–7, 2016. [4] L. R. P. Areias, E. F. P. Ruivo, M. T. Duarte, R. Moreira, S. D. Lucas, and R. C. Guedes, “RSC Advances PAPER A uni fi ed approach toward the rational design of selective low nanomolar human neutrophil elastase,” pp. 51717–51721, 2015. [5] “Uniprot.” [Online]. Available: http://www.uniprot.org/. [Accessed: 16-Aug-2017]. [6] W. Huang, Y. Yamamoto, Y. Li, D. Dou, K. R. Alliston, R. P. Hanzlik, T. D. Williams, and W. C. Groutas, “X-ray Snapshot of the Mechanism of Inactivation of Human Neutrophil Elastase by 1,2,5-Thiadiazolidin-3-one 1,1-Dioxide Derivatives.,” Society, pp. 2003–2008, 2008

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