Funktionelle Charakterisierung von Adenylatzyklasen der Honigbiene Apis mellifera

Adenylyl cyclases (ACs) are enzymes that synthesize the intracellular messenger adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP). The physiological impact of ACs has been intensively investigated in the mammalian brain and in the fruitfly Drosophila melanogaster. Some of the AC-enzymes are involved in processes underlying learning and memory. An organism, which is well suited for learning studies, is the honeybee Apis mellifera. The bee provides a rich behavioral repertoire that can be experimentally adressed. Within the last decades, several tests to study visual, olfactory, and tactile learning skills of the honeybee have been established. However, the cellular mechanisms and molecular components controlling the bees' behavior are largely unknown. In the beginning of this study, the molecular and biochemical properties of adenylyl cyclases in the bee had not been uncovered. I have cloned three genes (Amac2, Amac3, and Amac8) that encode membrane-bound ACs from honeybee brain. The amino-acid sequences have striking similarities to ACs from mammals and Drosophila. Heterologously expressed AmAC2t and AmAC3 proteins are activated by forskolin as well as by $\alpha$-subunits of stimulatory G-proteins (Gs$\alpha$). The Amac2-gene encodes an N-terminally truncated protein (AmAC2t). Notably, AmAC2t is the first truncated AC-enzyme that could be functionally expressed. The expression profile of the Amac3 gene was analyzed by in situ hybridization of braintissue sections. The Amac3 mRNA is predominatly expressed in the mushroom bodies, the optic lobes, and the deutocerebrum. To analyze the in vivo function of AmAC3, the expression of the Amac3 gene should be suppressed in the brain. To pursue such analyses, RNA interference (RNAi) is a promising technique. When Amac3-specific, double-stranded (ds) RNA is introduced into the honeybee brain, the endogenous Amac3 mRNA-level should be reduced. Bees that were injected with Amac3-dsRNA exhibited a higher responsiveness to sugar compared to controls. These results suggest that AmAC3 modulates the gustatory sensitivity of the animal. Interestingly, the injected bees had a higher amount of Amac3 mRNA than control bees. This unexpected finding evoked an alternative interpretation of the RNAi-effect. Further experiments are necessary, however, to uncover how the RNAi mechanism in the honeybee really works and to establish this method as a reliable tool to study gene function in this insect

In vitro proinflammatory gene expression changes in human whole blood after contact with plasma-treated implant surfaces

Background: The aim of this in vitro study was to identify changes in gene expression of proinflammatory cytokines in human whole blood after contact with titanium implant surfaces after plasma treatment. Materials and methods: Grade 4 titanium dental implants were conditioned with low-pressure plasma (LPP) and atmospheric-pressure plasma (APP) and submerged in human whole blood in vitro. Unconditioned implants and blood samples without implants served as control and negative control groups, respectively. Sampling was performed at 1, 8, and 24 h. Changes in mRNA expression levels of interleukin 1-beta (IL1-b) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) were assessed using RT-qPCR. Results: In the control group, significant increases in IL1-b and TNF-a expression were observed. Significant decreases in the expression of IL1-b and TNF-a were identified in blood with implants after plasma treatment. Conclusion: Differences in gene expression of proinflammatory cytokines after incubation of plasmaconditioned titanium implants can be assessed using human whole blood. The results of the present study indicate that plasma treatment (APP and LPP) of titanium dental implants leads to downregulation of proinflammatory cytokine gene expression, which might be beneficial in early osseointegration

ECS-Komplex – ein neuer Biomarker bei Wachstumshormonstörungen?

Störungen im Metabolismus des Wachstumshormons können sich als Wachstumshormonmangel oder -überschuss (Akromegalie) äußern. In beiden Fällen handelt es sich um seltene Krankheiten, die aufwendig behandelt werden müssen, da jeder Patient anders auf seine jeweilige Medikation anspricht. Zur Bestimmung des individuellen Ansprechverhaltens auf die medikamentöse Behandlung wird Insulin-like Growth Factor 1 verwendet, das jedoch als unzuverlässig für die Therapiekontrolle gilt. Um die Diagnostik und Therapie von Wachstumshormonstörungen zu verbessern, wurde in dieser Pilotstudie der Nutzen des neuen potenziellen Biomarkers Elongin B/C-Cullin5-Socs-box Komplex (ECS-Komplex) überprüft. Die fünf Proteine des Komplexes üben zusammen einen negativen Feedback-Mechanismus auf den Wachstumshormonrezeptor aus und regulieren ihn in Abhängigkeit vom Wachstumshormonspiegel im Blut. Für diese Pilotstudie wurden vier Patienten mit Wachstumshormondefizienz und 15 Patienten mit Akromegalie rekrutiert. Die Messung von Unterschieden in der Expression der Gene auf RNA-Ebene in Blutproben der Patienten erlaubt erste Aussagen über deren Eignung als therapeutische Marker für diese Krankheiten.Growth hormone (GH) dysfunctions can occur as a GH-deficiency (GHD) or an overproduction of GH, leading to acromegaly. Both are rare diseases, which have to be treated for many years before the correct individual dosage is found and a mitigation of symptoms can be achieved. Current medical therapy is determined by the levels of the insulin-like growth factor-1, which is considered to be an unreliable theranostic tool. In order to improve the diagnosis and therapy of patients with GH-dysfunctions, we investigated the benefits of the novel potential biomarker Elongin B/C-Cullin5-Socs-box complex (ECS-complex). Together, these proteins regulate the growth hormone receptor levels according to the blood GH concentration through a negative feedback loop. For this study, we were able to recruit four patients with a GHD and 15 patients with acromegaly. The detected differential expression of the ECS-complex in patients with growth hormone dysfunctions allows for first conclusions about the potential of those proteins as predictive biomarker molecules for individualized therapies

Studie über die Genregulation der Expression der 3alpha-Hydroxysteroid-Dehydrogenase im Bakterium Comamonas testosteroni

Die Fähigkeit vieler Mikroorganismen, Steroide und Steroidanaloga als Kohlenstoffquellen im Boden zu nutzen, ist schon lange bekannt. Die Mikroorganismen bauen zu diesem Zweck das energiereiche steroidale Ringsystem durch eine Vielzahl von Enzymen bis zur Bildung ringfreier Carbonsäuren und CO2 komplett ab. Der Abbau des Sterangerüstes kann nur durch Enzyme bakterieller und einiger niederer eukaryontischen Organismen bewerkstelligt werden. Zu diesen Organismen gehört das gram-negative Bakterium Comamonas testosteroni, das seine steroidabbauenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert, sondern einer Induktion durch die Substrate selbst unterliegt. Neben einer Reihe von steroidabbauenden Enzymen wurde auch das Schlüsselenzym 3alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase/Carbonylreduktase (3alpha-HSD/CR) identifiziert, das die Aromatisierung des A-Ringes durch Oxidation einleitet und dadurch den weiteren Steroidabbau ermöglicht. Als Ausgangssequenz wurde das Plasmid p6, ein in einen „high-copy-number“-Vektor kloniertes DNA-Fragment mit einer Größe von 5.275 kb, verwendet. p6 enthält die Gensequenz für die 3alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase (hsdA), die Gensequenz für ein weiteres am Steroidstoffwechsel beteiligtes Enzym (3-ksi) und vier offene Leserahmen (orf 1-4), die mögliche Regulationselemente der 3alpha-HSD codieren. Im Labor von Prof. Dr. E. Maser wurden mittels Computeranalysen von p6 zwei zu einander pallindromi-sche Sequenzen mit einer Länge von 10 Nukleotiden gefunden, die als mögliche Opera-toren fungieren (OP1, OP2). Es konnte mit Hilfe von EMSA eine spezifische Bindung eines von orf4 codierten Proteins (Repressor A) an die Operatoren der 3alpha-HSD und eine Blockade der Expression von hsdA nachgewiesen werden (Xiong et al, 2003). In Anwesenheit von Testosteron löst sich Repressor A von OP1/OP2 und ermöglicht so die Transkription von hsdA (Xiong et al., 2001). In weiterführenden Experimenten wurden die Repressorproteine mit Hilfe von His-tag-Säulen gereinigt und Antikörper präpariert. Als nächster Schritt ist hier der spezifische Bindungsnachweis von Repressor A an OP1 und OP2 mittels „Footprint-Analysen“ geplant. Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war, einen Beitrag zur Aufklärung der Regulation der 3alpha-HSD/CR zu leisten und weitere mögliche Regulationselemente zu identifizieren. Dabei lag der Schwerpunkt in der Herstellung von so genannten Marker Suicide Plasmiden, die durch gezielte Integration in die chromosomale DNA von Comamonas testosteroni bestimmte Regulationselemente – insbesondere orf2/Repressor B – in ihrer Funktionsweise stören bzw. zerstören sollten. Durch eine anschließende Messung der Expression von hsdA erhoffte man sich, Rückschlüsse auf die Funktionsweise dieser Regulationselemente ziehen zu können. Zur Integration der Marker Suicide Plasmide in chromosomale DNA wurden zwei verschieden Methoden verwendet: „Mating“ und Elektroporation: Es konnte gezeigt werden, dass beide Methoden effektiv sind und zu einer stabilen Integration führen. Die erfolgreiche Integration wurde mittels Kultur, PCR und Southern Blot bewiesen. Die Messungen der Expression von hsdA mit Hilfe von HPLC und ELISA zeigten keine eindeutigen Ergebnisse, die Rückschlüsse auf die vermutete Repressorfunktion von orf2/Repressor B zuließen. Weiterführende Untersu-chungen der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. E. Maser konnten nachweisen, dass orf2 seine repressorische Aktivität auf mRNA-Ebene entfaltet (Xiong et al., 2003). Die Entschlüsselung des Regulationsmechanismus des Enzyms 3alpha-Hydroxysteroid-dehydrogenase/Carbonylreduktase im steroid-metabolisierenden Bakterium C. testosteroni könnte Bedeutung haben für Medizin und Umwelt: Zum einen ist durch Applikation von gentechnisch veränderten steroidabbauenden Mikroorganismen eine neue Möglichkeit der Therapie von Patienten mit koronarer Herzkrankheit aufgrund einer Hypercholesterinämie vorstellbar. Zum anderen ist der Einsatz dieser Bakterien in Gewässern denkbar, die durch eine steroidbedingte Feminisierung gefährdet sind

Einfluss der Kryokonservierung auf die Immunantwort von Leukozyten

Die Messung von Zytokinen in Stimulationsexperimenten zur Bestimmung von Stärke und Umfang einer Immunreaktion werden in der Praxis häufig an kryokonserviertem Zellmaterial durchgeführt. Bisherige Untersuchungen zum Einfluss der Kryokonservierung auf die Zytokinexpression sind widersprüchlich. In den hier durchgeführten Experimenten wurden die Genexpression und/ oder Sekretion der Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α in frisch isolierten und kryokonservierten Immunzellen aus Blut (PBMC) eines gesunden Spenders bestimmt. Diese wurden mit den Immunsystem-aktivierenden Stoffen OKT-3 und Concanavalin A (Con A) stimuliert und für 4 bzw. 24 h kultiviert. Ein Vergleich der frisch-isolierten und kryokonservierten PBMC in Stimulationsexperimenten zeigt, (1) dass die Messung der Genexpression genauere Einblicke zu Beginn der einsetzenden Immunreaktion verschafft, als die Messung der ausgeschütteten Zytokine, (2) dass durch Einfrieren die Immunreaktion insbesondere zu diesem Zeitpunkt beeinflusst wird und (3) dass zu späteren Zeitpunkten die Konzentrationsbestimmung der Zytokine im Zellkulturüberstand das Mittel der Wahl ist.The measurement of cytokines in stimulation experiments with the aim to determine the strength and the complexitiy of an immune reaction is commonly carried out on cryopreserved cells. Previous studies, investigating the impact of cryopreservation on the cytokine expression, are inconsistent in their findings. Experiments conducted in this study determine the gene expression and/or secretion of IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ and TNF-α in freshly isolated and cryopreserved PBMC of a healthy donor. The cells were stimulated with the substances OKT-3 and Concanavalin A (Con A) and cultured for 4h and 24h. The comparison of freshly isolated and cryopreserved cells in stimulation experiments showed (1) that the measurement of the gene expression offers a more accurate insight into the immune-reaction at early timepoints than the measurement of the secreted cytokines; (2) that freezing of the cells affect the immune response at this early stage and (3) that at later points the measurement of secreted proteins is the method of choice

Einfluss von Kopienzahlvariationen auf die Tumorentwicklung

Tumorentstehung ist ein Prozess, bei dem die Abläufe innerhalb der Zelle schrittweise verändert werden. Die vielfältigen Interaktionen bei der Tumorentstehung sind jedoch bislang nicht vollständig erforscht. Bisher wurden vorwiegend Genexpressionsanalysen genutzt, die jedoch nur eine Zeitaufnahme aller Genexpressionen innerhalb der Zelle darstellen und somit allein nicht ausreichend zur Charakterisierung eines Tumors. Wir haben mithilfe von Affymetrix Mouse Diversity Genotyping Microarrays Mausbrustdrüsengewebe entsprechend unserem Dreistufen-Mausmodell analysiert und die Kopienzahländerungen berechnet. Wir fanden eine zunehmende stufenweise Änderung von den transgenen zu den Tumorproben. Die Berechnung von chromosomalen Segmenten mit gleicher Kopienzahl zeigte deutliche Fragmentmuster. Unsere Analysen zeigen, dass die Tumorentstehung ein schrittweiser Prozess ist, der sowohl durch Amplifikationen als auch Deletionen chromosomaler Abschnitte definiert ist. Wir fanden charakteristisch konservierte Fragmentierungsmuster und individuelle Unterschiede welche zur Tumorgenese beitragen

Bovine Cardiac Troponin I Gene (\u3cem\u3eTNNI3\u3c/em\u3e) as a Candidate Gene for Bovine Dilated Cardiomyopathy

The cardiac troponin complex, which is an important component of the contractile apparatus, is composed of the three subunits troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). Troponin I is the inhibitory subunit and consists of three isoforms encoded by TNNI1, TNNI2 and TNNI3 genes, respectively. Due to the different types of cardiomyopathies caused by mutations in the TNNI3 gene and its fluorescence in situ hybridization (FISH) mapping on bovine chromosome 18q26, which was shown to be linked to the recessively inherited bovine dilated cardiomyopathy (BDCMP), bovine TNNI3 was considered as candidate gene for BDCMP. Real-time polymerase chain reaction (PCR) TNNI3 expression analysis resulted in a significant difference between BDCMP affected and unaffected animals when normalized to ACTB gene expression, but there was no significant difference in expression when normalized to GAPDH. Northen blotting experiment was in agreement with the expression analysis and did not reveal a significant difference between the group of BDCMP affected and unaffected animals. Sequencing of the bovine TNNI3 gene revealed a single nucleotide polymorphism in intron 6 (c.378+315G\u3eA), but this single nucleotide polymorphism (SNP)was present regardless of the BDCMP status. In summary our data provide evidence to exclude the bovine TNNI3 gene as a candidate for BDCMP

Klonierung methylierungsabhängiger Gene in Neuroendokrinen Pankreastumorzellen durch cDNA Representational Difference Analysis (cDNA-RDA)

Hypermethylierung ist ein alternativer Mechanismus der frühen Gen-Inaktivierung in Tumorzellen. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass 5-Aza-2´-Deoxycytidin (5-Aza-CdR) neben morphologischen Veränderungen das Wachstum neuroendokriner Pankreastumorzellen QGP-1 inhibiert. Es daher wurde angenommen, dass der demethylierungs-assoziierte Phänotyp neben der nachgewiesenen Restoration der p16/CDKN2A Expression eine Konsequenz der Reexpression mehrerer durch abberante Methylierung supprimierte Gene ist. Um die Bedeutung der DNA Methylierung zu validieren hatte die vorliegende Arbeit zum Ziel, methylierungs-spezifische Transkripte in QGP-1 Zellen zu isolieren. Differentiell exprimierte Gene wurden durch die cDNA-Representational Difference Analysis (cDNA-RDA) isoliert, sequenziert und die methylierungasabhängige Expression durch semi-quantitative RT-PCR bestätigt. Es konnten 48 methylierungsabhängig differentiell exprimierte Genfragmente in QGP-1 Zellen bestätigt werden. Davon waren nach 5-Aza-2´-Deoxycytidin-Behandlung 26 Genfragmente verstärkt bzw. neu exprimiert, und 22 weitere Genfragmente signifikant schwächer exprimiert oder supprimiert. Die Sequenzanalyse der isolierten cDNA Fragmente zeigte Homologie zu 41 bekannten Genen. Sieben der cDNA Fragmente zeigten Homologie zu Genen mit bisher unbekannter Funktion. Bei einigen der klonierten Genen besteht ein Zusammenhang mit der Onkogenese anderer Tumorentitäten, sodass diese auch in neuroendokrinen Pankreastumorzellen eine pathogenetische Rolle spielen könnten. Interessant ist die 5-Aza-2´-Deoxycytidin induzierte Neuexpression von Cofilin-1, das über Depolymerisation von Aktin-Filamenten die Bewegungsfähigkeit der Zellen und somit das Metastasierungspotential reduziert, sowie die Repression von Matriptase, einer Serinprotease, die durch Matrixdegradation Metastasierung und invasives Wachstum fördert. Die vorliegende Arbeit weist darauf hin, dass DNA Methylierung ein Mechanismus in der Genese neuroendokriner Pankreastumorzellen ist, sodass es möglich wäre, zukünftig den Methylierungsstatus diagnostisch im Sinne eines Methylierungsfingerprint einzusetzen