Evolutionary analysis of polyproline motifs in Escherichia coli reveals their regulatory role in translation

Translation of consecutive prolines causes ribosome stalling, which is alleviated but cannot be fully compensated by the elongation factor P. However, the presence of polyproline motifs in about one third of the E. coli proteins underlines their potential functional importance, which remains largely unexplored. We conducted an evolutionary analysis of polyproline motifs in the proteomes of 43 E. coli strains and found evidence of evolutionary selection against translational stalling, which is especially pronounced in proteins with high translational efficiency. Against the overall trend of polyproline motif loss in evolution, we observed their enrichment in the vicinity of translational start sites, in the inter-domain regions of multi-domain proteins, and downstream of transmembrane helices. Our analysis demonstrates that the time gain caused by ribosome pausing at polyproline motifs might be advantageous in protein regions bracketing domains and transmembrane helices. Polyproline motifs might therefore be crucial for co-translational folding and membrane insertion

Translational Regulation of Environmental Adaptation in Bacteria

Bacteria must rapidly respond to both intracellular and environmental changes to survive. One critical mechanism to rapidly detect and adapt to changes in environmental conditions is control of gene expression at the level of protein synthesis. At each of the three major steps of translation—initiation, elongation, and termination—cells use stimuli to tune translation rate and cellular protein concentrations. For example, changes in nutrient concentrations in the cell can lead to translational responses involving mechanisms such as dynamic folding of riboswitches during translation initiation or the synthesis of alarmones, which drastically alter cell physiology. Moreover, the cell can fine-tune the levels of specific protein products using programmed ribosome pausing or inducing frameshifting. Recent studies have improved understanding and revealed greater complexity regarding long-standing paradigms describing key regulatory steps of translation such as start-site selection and the coupling of transcription and translation. In this review, we describe how bacteria regulate their gene expression at the three translational steps and discuss how translation is used to detect and respond to changes in the cellular environment. Finally, we appraise the costs and benefits of regulation at the translational level in bacteria

Translation elongation factor P and its post-translational modification enzyme EpmA

Protein translation is a non-uniform process, whereby especially proline-containing motifs lead to ribosome stalling events. Elongation factor P (EF P) rescues the ribosome by stimulation of peptidyl transfer. The four known subgroups of bacterial EF-Ps either require post-translational modification (PTM) established by EpmABC/EarP/YmfI or are functional without PTM. In Escherichia coli, the aminomutase EpmB converts (S)-α-lysine into (R)-β-lysine, which is subject to a two-step reaction catalyzed by lysyl-tRNA synthetase paralog EpmA. First, (R)-β-lysyl-adenylate is formed, from which the β-lysyl moiety is subsequently transferred to the ε-amino group of lysine 34 of EF P. This thesis focuses on the interplay of EF-P and EpmA which ensures EF P functionality in vivo and was used to modify EF-P with seven unnatural substrates in vitro. To detect PTM status two universal peptide antibodies, nonselective for the bacterial origin of EF-P, were generated and three subtypes of one-dimensional isoelectric focusing were established (native/denaturating horizontal, vertical). EpmA and EF-P protein copy numbers indicated balanced coordination to ensure outright modification status of EF-P during all growth phases, but no mutual regulation. EpmA’s donor substrate promiscuity was pinpointed to permit C6 scaffolds with at least an amino group at α- ((R/S)-α-lysine, 5-hydroxy-(S)-α-lysine), β- ((R/S)-β-lysine, (R)-3-aminocapronic acid) or ε-position (6-aminocapronic acid). In addition, EpmA variant A298G enabled modification of EF-P with (S)-α-ornithine. For the first time, known natural PTMs of EF P were expanded by seven synthetic PTMs. In vitro transcription translation assay demonstrated superiority of (R)-β-lysylation in ribosome rescue, explaining its evolutionary selection. Modification of EF-P with (S)-α-lysine was successfully achieved in vivo, when (R)-β-lysine synthesis was impeded (E. coli ΔepmB) and epmA(_A298G) overexpressed. In Bacillus subtilis, the ratio of unmodified-to-modified EF P varied over time. Out of 13 tested aminotransferase genes dat, epsN, gsaB, ilvK and yhdR are potentially involved in the yet unsolved modification pathway. In summary, the present work not only provides new biochemical insights into the functionalization of EF-P, but also paves the way to modify proteins post-translationally using EpmA.Die Translation von Proteinen ist kein gleichförmiger Prozess. Besonders bei Polyprolinmotiven treten Verzögerungen des Ribosoms auf. Hier übernimmt Elongationsfaktor P (EF-P) eine helfende Funktion und stimuliert den Peptidyltransfer. Die vier bekannten Gruppen von bakteriellen EF-P benötigen entweder posttranslationale Modifikation (PTM) durch EpmABC/EarP/YmfI, oder sind ohne PTM funktional. In Escherichia coli wandelt die Aminomutase EpmB (S)-α-Lysin in (R)-β-Lysin um. Ein Paralog der Lysyl-tRNA-Synthetase, EpmA, katalysiert die folgende zweistufige Reaktion. Erst wird (R)-β-Lysyladenylat gebildet, dessen β-Lysylgruppe dann auf die ε-Aminogruppe von Lysin 34 von EF-P übertragen wird. Diese Dissertation widmet sich dem Zusammenspiel von EF-P und EpmA. Dieses stellt in vivo die Funktion von EF-P sicher, in vitro erlaubt es die Modifikation von EF P mit sieben unnatürlichen Substraten. Zur Detektion des PTM Status wurden zwei universelle Peptidantikörper etabliert, die EF-P unabhängig von dessen bakterieller Herkunft detektieren, sowie drei Formen der eindimensionalen Isoelektrischen Fokussierung (nativ/denaturierend horizontal, vertikal). Die Kopienzahlen von EpmA und EF-P sind aufeinander abgestimmt, um vollständige Modifikation von EF-P in allen Wachstumsphasen sicherzustellen. Sie regulieren sich aber nicht gegenseitig. Die Promiskuität von EpmA erlaubt Donorsubstrate mit C6-Ketten, die zumindest eine Aminogruppe in α- ((R/S)-α-Lysin, 5-Hydroxy-(S)-α-lysin), β- ((R/S)-β-Lysin, (R)-3-Aminohexansäure) oder ε-Position (6-Aminohexansäure) haben. Zusätzlich ermöglicht die Enzymvariante EpmA_A298G (S)-α-Ornithylierung von EF-P. Erstmals konnten so die natürlichen PTMs von EF-P um sieben synthetische PTMs erweitert werden. In vitro Transkriptions/Translations-Assays zeigten die wirkungsvollste Ribosomen-rettung bei (R)-β-lysyliertem EF-P, was dessen evolutionäre Auswahl erklärt. In vivo gelang die Modifikation von EF-P mit (S)-α-Lysin, wenn die Fähigkeit zur (R)-β-Lysinsynthese fehlte (E. coli ΔepmB) und epmA(_A298G) überexprimiert wurde. In Bacillus subtilis variiert das Verhältnis von unmodifiziertem zu modifiziertem EF-P. Von 13 untersuchten Genen, die Aminotransferasen kodieren, sind dat, epsN, gsaB, ilvK und yhdR möglicherweise am ungeklärten Modifikationsweg beteiligt. Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit nicht nur neue biochemische Einsichten in die Funktionalisierung von EF-P, sondern eröffnet auch einen neuen Weg, Proteine mittels EpmA posttranslational zu modifizieren

Translation elongation factor P and its post-translational modification enzyme EpmA

Protein translation is a non-uniform process, whereby especially proline-containing motifs lead to ribosome stalling events. Elongation factor P (EF P) rescues the ribosome by stimulation of peptidyl transfer. The four known subgroups of bacterial EF-Ps either require post-translational modification (PTM) established by EpmABC/EarP/YmfI or are functional without PTM. In Escherichia coli, the aminomutase EpmB converts (S)-α-lysine into (R)-β-lysine, which is subject to a two-step reaction catalyzed by lysyl-tRNA synthetase paralog EpmA. First, (R)-β-lysyl-adenylate is formed, from which the β-lysyl moiety is subsequently transferred to the ε-amino group of lysine 34 of EF P. This thesis focuses on the interplay of EF-P and EpmA which ensures EF P functionality in vivo and was used to modify EF-P with seven unnatural substrates in vitro. To detect PTM status two universal peptide antibodies, nonselective for the bacterial origin of EF-P, were generated and three subtypes of one-dimensional isoelectric focusing were established (native/denaturating horizontal, vertical). EpmA and EF-P protein copy numbers indicated balanced coordination to ensure outright modification status of EF-P during all growth phases, but no mutual regulation. EpmA’s donor substrate promiscuity was pinpointed to permit C6 scaffolds with at least an amino group at α- ((R/S)-α-lysine, 5-hydroxy-(S)-α-lysine), β- ((R/S)-β-lysine, (R)-3-aminocapronic acid) or ε-position (6-aminocapronic acid). In addition, EpmA variant A298G enabled modification of EF-P with (S)-α-ornithine. For the first time, known natural PTMs of EF P were expanded by seven synthetic PTMs. In vitro transcription translation assay demonstrated superiority of (R)-β-lysylation in ribosome rescue, explaining its evolutionary selection. Modification of EF-P with (S)-α-lysine was successfully achieved in vivo, when (R)-β-lysine synthesis was impeded (E. coli ΔepmB) and epmA(_A298G) overexpressed. In Bacillus subtilis, the ratio of unmodified-to-modified EF P varied over time. Out of 13 tested aminotransferase genes dat, epsN, gsaB, ilvK and yhdR are potentially involved in the yet unsolved modification pathway. In summary, the present work not only provides new biochemical insights into the functionalization of EF-P, but also paves the way to modify proteins post-translationally using EpmA.Die Translation von Proteinen ist kein gleichförmiger Prozess. Besonders bei Polyprolinmotiven treten Verzögerungen des Ribosoms auf. Hier übernimmt Elongationsfaktor P (EF-P) eine helfende Funktion und stimuliert den Peptidyltransfer. Die vier bekannten Gruppen von bakteriellen EF-P benötigen entweder posttranslationale Modifikation (PTM) durch EpmABC/EarP/YmfI, oder sind ohne PTM funktional. In Escherichia coli wandelt die Aminomutase EpmB (S)-α-Lysin in (R)-β-Lysin um. Ein Paralog der Lysyl-tRNA-Synthetase, EpmA, katalysiert die folgende zweistufige Reaktion. Erst wird (R)-β-Lysyladenylat gebildet, dessen β-Lysylgruppe dann auf die ε-Aminogruppe von Lysin 34 von EF-P übertragen wird. Diese Dissertation widmet sich dem Zusammenspiel von EF-P und EpmA. Dieses stellt in vivo die Funktion von EF-P sicher, in vitro erlaubt es die Modifikation von EF P mit sieben unnatürlichen Substraten. Zur Detektion des PTM Status wurden zwei universelle Peptidantikörper etabliert, die EF-P unabhängig von dessen bakterieller Herkunft detektieren, sowie drei Formen der eindimensionalen Isoelektrischen Fokussierung (nativ/denaturierend horizontal, vertikal). Die Kopienzahlen von EpmA und EF-P sind aufeinander abgestimmt, um vollständige Modifikation von EF-P in allen Wachstumsphasen sicherzustellen. Sie regulieren sich aber nicht gegenseitig. Die Promiskuität von EpmA erlaubt Donorsubstrate mit C6-Ketten, die zumindest eine Aminogruppe in α- ((R/S)-α-Lysin, 5-Hydroxy-(S)-α-lysin), β- ((R/S)-β-Lysin, (R)-3-Aminohexansäure) oder ε-Position (6-Aminohexansäure) haben. Zusätzlich ermöglicht die Enzymvariante EpmA_A298G (S)-α-Ornithylierung von EF-P. Erstmals konnten so die natürlichen PTMs von EF-P um sieben synthetische PTMs erweitert werden. In vitro Transkriptions/Translations-Assays zeigten die wirkungsvollste Ribosomen-rettung bei (R)-β-lysyliertem EF-P, was dessen evolutionäre Auswahl erklärt. In vivo gelang die Modifikation von EF-P mit (S)-α-Lysin, wenn die Fähigkeit zur (R)-β-Lysinsynthese fehlte (E. coli ΔepmB) und epmA(_A298G) überexprimiert wurde. In Bacillus subtilis variiert das Verhältnis von unmodifiziertem zu modifiziertem EF-P. Von 13 untersuchten Genen, die Aminotransferasen kodieren, sind dat, epsN, gsaB, ilvK und yhdR möglicherweise am ungeklärten Modifikationsweg beteiligt. Zusammengefasst liefert die vorliegende Arbeit nicht nur neue biochemische Einsichten in die Funktionalisierung von EF-P, sondern eröffnet auch einen neuen Weg, Proteine mittels EpmA posttranslational zu modifizieren

Translation Initiation Rate Determines the Impact of Ribosome Stalling on Bacterial Protein Synthesis

Ribosome stalling during translation can be caused by a number of characterized mechanisms. However, the impact of elongation stalls on protein levels is variable, and the reasons for this are often unclear. To investigate this relationship, we examined the bacterial translation elongation factor P (EF-P), which plays a critical role in rescuing ribosomes stalled at specific amino acid sequences including polyproline motifs. In previous proteomic analyses of both Salmonella and Escherichia coli efp mutants, it was evident that not all proteins containing a polyproline motif were dependent on EF-P for efficient expression in vivo . The α- and β-subunits of ATP synthase, AtpA and AtpD, are translated from the same mRNA transcript, and both contain a PPG motif; however, proteomic analysis revealed that AtpD levels are strongly dependent on EF-P, whereas AtpA levels are independent of EF-P. Using these model proteins, we systematically determined that EF-P dependence is strongly influenced by elements in the 5′-untranslated region of the mRNA. By mutating either the Shine-Dalgarno sequence or the start codon, we find that EF-P dependence correlates directly with the rate of translation initiation where strongly expressed proteins show the greatest dependence on EF-P. Our findings demonstrate that polyproline-induced stalls exert a net effect on protein levels only if they limit translation significantly more than initiation. This model can be generalized to explain why sequences that induce pauses in translation elongation to, for example, facilitate folding do not necessarily exact a penalty on the overall production of the protein

The translation elongation factor P in actinobacteria

The incorporation of consecutive prolines into a nascent peptide chain triggers ribosome stalling and requires rescue via a specific, universally conserved, translation elongation factor – bacterial EF-P and archaeal/eukaryotic a/eIF5A. In Eukarya, Archaea and all bacteria investigated so far, the functionality of this translation elongation factor depends on specific and rather unusual post-translational modifications. Actinobacteria, which includes the genera Corynebacterium, Streptomyces and Mycobacterium is of both medical and economical significance. This work focuses on the EF-P proteins from the most prominent Actinobacteria. Structure, mechanism of action, expression and specific physiological effects in the cells are explored. Proteomic analysis of C. glutamicum revealed that EF-P is required for the translation of proteins involved in amino acid and secondary metabolite production. Analysis of the protein functionality, molecular mass, charge and X-ray crystal structure showed evidence that Actinobacterial EF-P does not require any post-translational modification for activation. While the function and overall 3D structure of this EF-P type is conserved, the β2Ωβ3 loop containing the conserved lysine32 is flanked by two essential prolines (P30 and P34) that rigidify it. Amino acid substitutions that increased the flexibility of this loop completely inhibit EF-P function. This new EF-P subfamily is found in 11% of all bacteria. The genome of C. glutamicum encodes 1,468 polyproline motifs, many of which are found in transcriptional regulators and carbohydrate transporters. The requirement of EF-P for translation of carbohydrate transporters can be a bottleneck in the performance of industrial strains. The EIIGlc - glucose-specific permease of the phosphoenolpyruvate (PEP): sugar phosphotransferase system (PTS) - encoded by ptsG, is the most important glucose uptake system of C. glutamicum. Due to the presence of a polyproline, production of EIIGlc is strongly reduced in the Δefp mutant strain, resulting in a lower glucose uptake rate and growth defect. The polyproline motif is essential for functionality and could not be replaced by any other amino acid sequence in an unbiased random mutagenesis. GntR2, a transcriptional activator of ptsG, is also dependent on EF-P. However, its reduced copy number can be compensated for by other regulators. Analysis of C. glutamicum and S. coelicolor cell lysates revealed that EF-P is upregulated in the early stationary phase, a time point in which Actinobacteria produce and secrete large amounts of amino acids and other secondary metabolites. Evolutionary analysis of polyproline motifs in the proteome of S. coelicolor provided evidence of evolutionary selection against translational stalling in the core proteome, but not in the enzymes responsible for secondary metabolite production. Proteins essential for antibiotics production contain up to 15 polyproline motifs and without EF-P, production of coelimycin P1, undecylprodigiosin and actinorhodin were only a fraction of the parental strain. This thesis provides evidence that EF-P is active without post-translational modifications in the most prominent Actinobacteria. Moreover, it acts as a bottleneck in the translation of carbohydrate transporters and enzymes of secondary metabolism.Der Einbau konsekutiver Proline in eine entstehende Peptidkette führt zu einem ungewollten Stopp der Translation am Ribosom. Dieser Arrest kann aufgehoben werden durch einen spezifischen, universell konservierten Translations-Elongationsfaktor - bakterielles EF-P und archäales/eukaryotisches a/eIF5A. Bei Eukaryoten, Archaeen und allen bisher untersuchten Bakterien hängt die Funktionalität des Translations-Elongationsfaktors von spezifischen und eher ungewöhnlichen post-translationalen Modifikationen ab. Actinobacteria, zu denen die Gattungen Corynebacterium, Streptomyces und Mycobacterium gehören, sind sowohl von medizinischer als auch von wirtschaftlicher Bedeutung. Diese Arbeit fokussiert sich auf die EF-P-Proteine der prominentesten Actinobacteria, untersucht werden ihre Struktur, ihren Funktionsmechanismus, Expression und spezifische physiologische Effekte. Die Proteomanalyse von C. glutamicum ergab, dass EF-P für die Translation von Proteinen erforderlich ist, welche an der Produktion von Aminosäuren und Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Die Eigenschaften der posttranslationalen Modifikation von EF-P wurde in Corynebacterium glutamicum, Streptomyces coelicolor und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Die Analyse der Proteinfunktionalität, der molekularen Masse, der Ladung und der Röntgenkristallstruktur führte zu Hinweisen, dass in Actinobakterien EF-P keine posttranslationale Modifikation zur Aktivierung benötigt. Während die Funktion und die gesamte 3D-Struktur dieses EF-P-Typs konserviert ist, wird die β2Ωβ3 Schleife, die das konservierte Lysin32 enthält, von zwei essentiellen Prolinen (P30 und P34) flankiert, die deren Flexibilität einschränken. Aminosäuresubstitutionen, die die Schleife flexibler machen, hemmen die EF-P-Funktion vollständig. Diese neue EF-P-Unterfamilie ist in 11 % aller Bakterien zu finden. Das Genom von C. glutamicum kodiert für 1.468 Polyprolin-Motive, von denen viele in Transkriptionsregulatoren und Kohlenhydrattransportern zu finden sind. Die Notwendigkeit von EF-P für die Translation von Kohlenhydrattransportern kann ein Engpass in der Proteinproduktion sein, der die Leistung industrieller Stämme beeinträchtigt. EIIGlc – die Glukose-spezifische Permease des Phosphoenolpyruvats (PEP): Zucker-Phosphotransferase-System (PTS) – kodiert durch ptsG, ist das wichtigste Glukoseaufnahmesystem von C. glutamicum. Da ein Polyprolin vorhanden ist, ist die Produktion von EIIGlc im efp Deletionsstamm stark reduziert, was zu einer geringeren Glukoseaufnahmerate und einem Wachstumsdefekt führt. Das Polyprolin-Motiv ist für die Funktionalität essentiell und konnte in einer „unbiased random mutagenesis“ nicht durch eine andere Aminosäuresequenz ersetzt werden. GntR2, ein Transkriptionsaktivator von ptsG, ist ebenfalls EF-P-abhängig. Eine reduzierte Kopienzahl von GntR2 kann jedoch durch andere Regulatoren kompensiert werden. Die Analyse der Zelllysate von C. glutamicum und S. coelicolor zeigte, dass die Menge an EF-P in der frühen stationären Phase hochreguliert wird, einem Zeitpunkt, zu dem Actinobakterien bekanntlich große Mengen an Aminosäuren und anderen Sekundärmetaboliten produzieren und sezernieren. Die evolutionäre Analyse von Polyprolin-Motiven im Proteom von S. coelicolor ergab Hinweise auf eine evolutionäre Selektion gegen Arrestmotive im Kernproteom, nicht aber in den Enzymen, die für die Produktion von Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Proteinkomplexe, die für die Antibiotika-Produktion essentiell sind, enthalten bis zu 15 Polyprolin-Motive. In einer efp Deletionsmutante war die Produktion von Coelimycin P1, Undecylprodigiosin und Actinorhodin äußerst stark reduziert. Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass EF-P ohne posttranslationale Modifikationen in den bekanntesten Actinobacteria aktiv ist. Außerdem bildet EF-P einen Engpass bei der Translation von Kohlenhydrattransportern und Enzymen des Sekundärstoffwechsels

Switching the Post-translational Modification of Translation Elongation Factor EF-P

Tripeptides with two consecutive prolines are the shortest and most frequent sequences causing ribosome stalling. The bacterial translation elongation factor P (EF-P) relieves this arrest, allowing protein biosynthesis to continue. A seven amino acids long loop between beta-strands β3/β4 is crucial for EF-P function and modified at its tip by lysylation of lysine or rhamnosylation of arginine. Phylogenetic analyses unveiled an invariant proline in the -2 position of the modification site in EF-Ps that utilize lysine modifications such as Escherichia coli. Bacteria with the arginine modification like Pseudomonas putida on the contrary have selected against it. Focusing on the EF- Ps from these two model organisms we demonstrate the importance of the β3/β4 loop composition for functionalization by chemically distinct modifications. Ultimately, we show that only two amino acid changes in E. coli EF-P are needed for switching the modification strategy from lysylation to rhamnosylation

Advancements in recombinant technology for production of butyrylcholinesterase, a bioscavenger of nerve agents

Butyrylcholinesterase (BChE) is a serine hydrolase present in plasma and other mammalian tissues. As a target of organophosphorous pesticides and warfare nerve agents, BChE acts as their stoichiometric bioscavenger. However, so far it has been a significant challenge to produce BChE at large scales and low cost. For decades, numerous research efforts have been directed first at isolation from human volunteers and later at production of BChE in eukaryotic and prokaryotic expression systems. In this review we focused on recent studies on recombinant BChE discussing reasons why the efficient, economically sensible expression system for recombinant butyrylcholinesterase is hard to develop. We also bring the most recent advancements in the use of expression of human BChE in vivo as an effective prophylactic against organophosphate poisoning.</p