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Molekularer Mechanismus der Fas Ligand-induzierten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase
Das endo-lysosomale Enzym saure Sphingomyelinase (A-SMase) ist ein wichtiges Element der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose. Im CD95-Signalweg ist die Translokation der A-SMase zur Ă€uĂeren Zellmembran von besonderer Bedeutung. An der ZelloberflĂ€che katalysiert die A-SMase die Hydrolyse von Sphingomyelin und ermöglicht die Bildung von Ceramid-angereicherten MembrandomĂ€nen. Dies bewirkt das Clustern des CD95-Rezeptors, eine verstĂ€rkte Rekrutierung der Adaptorproteine FADD und Caspase 8 sowie die Induktion einer apoptotischen, proteolytischen Kaskade. Jedoch ist bisher unbekannt, ob der A-SMase wĂ€hrend der Rezeptor-Internalisierung eine weitere Funktion in der CD95-Signaltransduktion zukommt. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Internalisierung des CD95-Rezeptors zu analysieren und eine enzymatisch aktive A-SMase in den CD95-enthaltenden Endosomen (Rezeptosomen) nachzuweisen. Die magnetische Isolierung des zu unterschiedlichen Zeitpunkten internalisierten CD95-Rezeptors ermöglichte eine zeitabhĂ€ngige Analyse der Rekrutierung von Adaptorproteinen. In der Western-Blot Analyse lieĂ sich mit dem verstĂ€rkten Auftreten von FADD und
Caspase 8 die Bildung des DISC (death-inducing signaling complex) nachweisen. Die Detektion Kompartiment-spezifischer Markerproteine veranschaulichte zudem die Fusion zwischen CD95-Rezeptosomen und Rab 4A- oder Cathepsin D-positiven Vesikeln. DarĂŒber hinaus lieĂ sich mit verschiedenen methodischen AnsĂ€tzen eine biphasisch aktivierte A-SMase in den magnetischen Fraktionen identifizieren. Der erste AktivitĂ€tsanstieg korrelierte mit einer verstĂ€rkten Translokation der A-SMase an die ZelloberflĂ€che und konnte durch den Caspase 8-Inhibitor IETD blockiert werden. Die Inhibition der CD95-Internalisierung durch den Dynamin-Inhibitor Dynasore reduzierte dagegen den zweiten AktivitĂ€tsanstieg der A-SMase in den
CD95-Rezeptosomen. Auf Grundlage dieser Inhibitionsversuche lieĂ sich das biphasische AktivitĂ€tsprofil mit der Caspase 8-abhĂ€ngigen Translokation der A-SMase zur Plasmamembran sowie mit der anschlieĂenden CD95-Internalisierung in Verbindung setzen. Interessanterweise fĂŒhrte auch die Behandlung mit dem Caspase 3/7-Inhibitor DEVD zu einer Inhibition des zweiten AktivitĂ€tsanstiegs der A-SMase. Weitere Analysen zeigten, dass Caspase 3 und 7 in den
CD95-Rezeptosomen angereichert sind und direkt mit der A-SMase interagieren. In vitro lieĂ sich zudem die Caspase 3- und 7-vermittelte proteolytische Aktivierung der A-SMase nachweisen. Diese Ergebnisse lassen somit darauf schlieĂen, dass der zweite AktivitĂ€tsanstieg der A-SMase auf einem Caspase 3- oder 7-abhĂ€ngigen Aktivierungsmechanismus in internalisierten CD95-Rezeptosmen beruht
Saposin B und D: Heterologe Expression in <i>Pichia pastoris</i> und biophysikalische Charakterisierung
Die vier Saposine (Saps) A-D sind kleine, enzymatisch inaktive Glykoproteine, die in Lysosomen lokalisiert sind. Trotz ihrer hohen Sequenzhomologie zeigen sie als membranaktive, wasserlösliche Lipidbindungs- und Transferproteine unterschiedliche SpezifitĂ€ten und Mechanismen. Zusammen mit dem GM2-Aktivatorprotein sind die Saps essentielle Cofaktoren fĂŒr den Abbau von Glykosphingolipiden (GSL) mit kurzen Oligosaccharidketten, die sie an der Membran-Wasser-GrenzflĂ€che fĂŒr Exohydrolasen zugĂ€nglich machen. Nach einer gut gesicherten Hypothese erreichen die fĂŒr den Abbau bestimmten Bestandteile der Zellmembran nach ihrer Endozytose intraendosomale und âlysosomale Membranstrukturen. Letztere unterscheiden sich von der begrenzenden Membran durch das Fehlen einer schĂŒtzenden Glykokalix, sie enthalten fast kein Cholesterol, dafĂŒr aber das lysosomale Markerlipid Bis(monoacylglycero)phosphat (BMP). Im Rahmen dieser Arbeit wurde funktionales Sap-B und -D heterolog in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert, so daĂ eine Kontamination mit anderen Saps ausgeschlossen werden konnte. Ihre Expression und Aufreinigung wurden zur Steigerung der Ausbeute an die DurchfĂŒhrung in einem Bioreaktor angepaĂt. Die Interaktion der rekombinanten Saps mit den intralysosomalen, vesikulĂ€ren Membranen wurde an Liposomen nachgestellt und mittels Dynamischer Lichtstreuung und OberflĂ€chenplasmonresonanz-Spektroskopie untersucht; fĂŒr letztere Methode wurden die Liposomen reversibel immobilisiert. WĂ€hrend Sap-B die GröĂe von Liposomen in Suspension nicht verĂ€nderte, lieĂ Sap-D BMP-haltige Liposomen bei saurem pH aggregieren. Sowohl Sap-B als auch Sap-D banden an immobilisierte Liposomen. Glykosyliertes Sap-B störte bei saurem pH-Wert die MembranintegritĂ€t und löste so Lipide aus den Liposomen. Gefördert wurde dieser ProzeĂ durch die Anwesenheit von BMP; Cholesterol dagegen stabilisierte die Liposomen. Bei unglykosyliertem Wildtyp-Sap-B und zuckerfreien Varianten mit verĂ€nderter Glykosylierungsequenz war die FĂ€higkeit zur Lipidextraktion vermindert. Damit konnte zum ersten mal eine Funktion fĂŒr die Glykosylierung von Sap-B unter physiologischen Bedingungen gezeigt werden. Eine dieser Sap-B-Varianten, bei der Asparagin 215 durch Histidin ersetzt ist, verursacht beim Menschen eine tödliche Sphingolipidspeicherung, die durch ein Krankheitsbild Ă€hnlich der Metachromatischen Leukodystrophie gekennzeichnet ist. Sap-D konnte nur in der unglykosylierten Form exprimiert werden, die im liposomalen in vitro Assay, aber auch in Zellkultur aktiv war, und das erstmals kristallisiert werden konnte. Die FĂ€higkeit zur Lipidmobilisierung war deutlich geringer ausgeprĂ€gt als bei Sap-B und konnte durch den Austausch einer positiv geladenen AminosĂ€ure (Arginin 15 gegen Glutamat), die im fĂŒr die Membranbindung vermutlich relevanten Bereich des Proteins liegt , vollstĂ€ndig ausgeschaltet werden
Kontrolle der lateralen Organisation von Membranproteinen
In den letzten Jahrzehnten wurde bei Untersuchungen an Zellmembranen deutlich, dass viele Membranproteine nicht, wie ursprĂŒnglich angenommen, homogen verteilt sind, sondern in MikrodomĂ€nen organisiert vorkommen. Die Mechanismen, die der Formierung dieser Strukturen zugrunde liegen, sind bisher jedoch nur teilweise verstanden. Bestehende Modelle erklĂ€ren die strukturelle Organisation von Zellmembranen vorwiegend durch Lipid-Lipid- oder Lipid-Protein-Interaktionen. Bisher wurde jedoch kaum analysiert, inwiefern auch andere im Zellsystem vorkommende Bindungspartner die Verteilung von Proteinen in der Plasmamembran beeinflussen können. In der vorliegenden Dissertation wurde deshalb der Einfluss verschiedener extra- und intrazellulĂ€rer Interaktionspartner auf die Anordnung von Membranpro-teinen genauer untersucht. Unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Fluores-zenzmikroskopie-Techniken wurden hierfĂŒr Versuche sowohl an intakten Zellen, als auch an speziellen Plasmamembran-PrĂ€parationen durchgefĂŒhrt. Im ersten Teil der Arbeit konnte am Beispiel des humanen Insulin-Rezeptors (hIR) nachgewiesen werden, dass weder Interaktionen mit intrazellulĂ€ren Faktoren, noch die Stimulation des Rezeptors, noch Wechselwirkungen mit der Glykokalix einen Einfluss auf das Diffusionsverhalten des Proteins in der Membran haben. Es wurden jedoch Indizien gefunden, dass Bereiche der extrazellulĂ€ren DomĂ€ne des hIRs fĂŒr die MobilitĂ€t und damit fĂŒr die laterale Organisation des Rezeptors in der Plasmamembran entscheidend sind. In einem zweiten Projekt wurde die Wechselwirkung zwischen Ca2+ und zytoplasmatischen ProteindomĂ€nen anhand zweier SNARE-Proteine untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass Calcium-Ionen die Membranorganisation der untersuchten Proteine modulieren. Mit Hilfe verschiedener Analysemethoden konnte ein direkter Zusammenhang zwischen erhöhter Calcium-Ionen-Konzentration und einer verstĂ€rkten Aggregation von SNARE-Proteinen in MikrodomĂ€nen nachgewiesen werden. Es gab hierbei deutliche Hinweise, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Calcium-Ionen und intrazellulĂ€ren ProteindomĂ€nen zu einer Ănderung der Anordnung von SNARE-Proteinen in der Membran fĂŒhren. Der Einfluss einer indirekten Wirkung der Calcium-Ionen auf die Anordnung der untersuchten Proteine ĂŒber SekundĂ€reffekte der erhöhten Ionen-Konzentration erwies sich indessen als unwahrscheinlich. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ein Modell entworfen werden, mit dem ein höherer Grad an Cluster-Bildung der untersuchten Membranproteine durch direkte elektrostatische Interaktionen mit Calcium-Ionen erklĂ€rt wird. Ein vergleichbarer Mechanismus wurde bisher noch nicht beschrieben und stellt eine ErgĂ€nzung zu den bisher gĂ€ngigen Theorien zur Membranorganisation dar
Der humane Transporter EAAT 3 ist ein Kandidat fĂŒr die Vermittlung der L-Glutamat-Aufnahme in Plasmodium falciparum-infizierte Erythrozyten
Der obligat intrazellulĂ€re Parasit Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica, vollzieht einen Teil seiner Entwicklung in humanen Erythrozyten. Aus immunologischer Sicht stellt der Erythrozyt als Wirtszelle eine sichere Umgebung dar. Er erweist sich jedoch fĂŒr die NĂ€hrstoffversorgung des Parasiten als unzureichend. Im Verlauf der Infektion induziert der Parasit daher eine umfassende PermeabilitĂ€tsĂ€nderung der Plasmamembran der befallenen Wirtszelle. Diese neu induzierten Transportwege werden kollektiv als âNovel Permeation Pathwaysâ (NPP) bezeichnet. Sie dienen dem Parasiten als Aufnahmeweg fĂŒr die benötigten essentiellen NĂ€hrstoffe aus dem umgebenden Plasma und zur Ausschleusung der anfallenden toxischen Stoffwechselprodukte. Im Fokus dieser Arbeit steht die Charakterisierung des vom Parasiten induzierten Transportwegs fĂŒr AminosĂ€uren sowie die Identifizierung der beteiligten Transportproteine. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit Natriumarsenit eine den NPP Ă€hnliche PermeabilitĂ€t fĂŒr negativ geladene AminosĂ€uren in nicht-infizierten Erythrozyten induziert werden kann. Die induzierte PermeabilitĂ€t zeigt dabei Charakteristika eines EAAT-vermittelten Transports. Sie ist stereoselektiv fĂŒr das L-Enantiomer von Glutamat und weist eine strikte AbhĂ€ngigkeit von Natrium auf. Ebenso kann der vermittelte Transport mit den EAAT-spezifischen Inhibitoren cis-ACBD und HIP-A blockiert werden. Als möglicher Kandidat fĂŒr die Vermittlung der mit Natriumarsenit induzierbaren PermeabilitĂ€t konnte der Glutamattransporter EAAT3 benannt werden, der in dieser Arbeit in humanen Erythrozyten nachgewiesen werden konnte.
FĂŒr die NPP der infizierten Erythrozyten konnte gezeigt werden, dass sie fĂŒr die Aufnahme der untersuchten AminosĂ€uren mindestens drei unabhĂ€ngige Transportwege umfassen mĂŒssen. Hierbei konnten auch Charakteristika der Natriumarsenit-induzierbaren PermeabilitĂ€t bei den NPP nachgewiesen werden. So konnte gezeigt werden, dass die L-Glutamat-Aufnahme in infizierten Erythrozyten zu einem Teil abhĂ€ngig von Natrium ist und partiell mit EAAT-spezifischen Inhibitoren gehemmt werden kann. Dies ist ein Hinweis auf die mögliche Beteiligung von EAAT3 an der Aufnahme von L-Glutamat in infizierte Zellen
Charakterisierungsstudien der biologischen und neurotrophen Eigenschaften des cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF)
Neurotrophe Faktoren ermöglichen das Ăberleben von Neuronen auch unter pathologischen
Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler Zellstrukturen nach BeschÀdigung.
Neurotrophe Faktoren sind definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach
Strukturhomologien, Rezeptoren und Signaltransduktionswegen in verschiedene Familien
unterteilt. Die Bezeichnung âneurotropher Faktorâ umfasst Proteine mit unterschiedlichsten
Funktionen. Die neurotrophen Eigenschaften von CDNF, das zur CDNF/MANF
Proteinfamilie gehört, wurden durch intrastriatale Injektion und darauf folgende Protektion
und Proliferation von Neuronen in einem in vivo SchÀdigungsmodell nachgewiesen. Diese
Proteinfamilie könnte somit einen neuen Ansatz zu einer Therapiemöglichkeit von
neurodegenerativen Krankheiten bieten. CDNF und MANF haben ein Molekulargewicht von
ungefÀhr 21 kDa. Der Aminoterminus enthÀlt eine globulÀre Saposin-Àhnliche (saposin like
protein SAPLIP)-DomÀne, und der Carboxyterminus ist verwandt mit der Sequenz von
scaffold attachment factors (SAFs) und enthÀlt analog zu SAFs eine redoxaktive
CysteinbrĂŒcke eingebettet in ein CXXC-Motiv. Die biologische Funktion, Rezeptoren und
Wirkmechanismus der Neuroprotektion der CDNF/MANF Proteinfamilie sind bisher
unbekannt. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Versuche zur Charakterisierung der
Eigenschaften von CDNF und dessen SAPLIP-DomĂ€ne unternommen. FĂŒr alle Versuche
waren umfangreiche biotechnologische Vorarbeiten notwendig, die in der Forschungsabteilung
von CSL Behring, Marburg vorgenommen wurden.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der ĂberprĂŒfung der These, dass CDNF, ausgehend
von seiner SAPLIP-DomĂ€ne, transduktorische Eigenschaften besitzen könnte: MakromolekĂŒle
in Zellen zu schleusen, ist durch die selektiv durchlÀssige Zellmembran nur sehr
beschrÀnkt möglich. Diese Restriktionen erlauben nur einem sehr kleinen Teil möglicher
therapeutischer Substanzen den Zugang ins Zellinnere. Die natĂŒrliche Struktur von
beispielsweise Proteinen verhindert das passive Eindringen dieser Stoffe in die Zelle. In den
1980er Jahren wurden jedoch Peptidsequenzen entdeckt, die als MolekĂŒltransporter
MakromolekĂŒle in das Zellinnere schleusen können. Die N-terminalen DomĂ€ne von CDNF
besitzt nicht die klassische Struktur proteinogener MolekĂŒltransporter, sie ist jedoch verwandt
mit Saposinen. Saposine und Saposin-Àhnliche DomÀnen weiterer Proteine können Lipide
binden oder Zellmembranen permeabilisieren. Diese Eigenschaften fĂŒhrten zu der These, dass
auch die SAPLIP-DomĂ€ne von CDNF potentielle transduktorische Funktionen ausĂŒben
könnte. Zur ĂberprĂŒfung der These wurden CDNF-Fusionsproteine biotechnologisch
produziert und auf ihre transduktorischen Eigenschaften untersucht. Es konnte aber keine
Transduktion von CDNF oder Assoziation mit der Zellmembran detektiert werden.
Der zweite Teil der Arbeit zeigt die zellulÀre Lokalisation von nativem CDNF. CDNF wird
als sekretierter neurotropher Faktor beschrieben. Die C-terminale KTEL-Sequenz von CDNF
weist jedoch eine groĂe Ăhnlichkeit zum allgemeinen ER-Retentionssignal KDEL auf. Wir
zeigen in dieser Arbeit mit unterschiedlichen Methoden zum ersten Mal, dass CDNF
tatsÀchlich im ER retardiert wird. Es wurden weiterhin CDNF-Mutanten mit verÀndertem CTerminus
produziert. Die CDNF-Mutante mit C-terminaler KDEL-Sequenz und natives
CDNF konnten nicht im Ăberstand von transfizierten SĂ€ugetier-Zellkulturen detektiert
werden. Im Gegensatz zu CDNF-Mutanten mit deletiertem, maskiertem oder anderweitig
verĂ€ndertem C-Terminus, die im KulturĂŒberstand nachweisbar waren. Dieser Vergleich mit
unterschiedlichen CDNF-Mutanten zeigt die wichtige Funktion einer freien C-terminalen
KTEL-Sequenz bei der zellulÀren Lokalisation von CDNF.
Der dritte Teil der Arbeit beschÀftigt sich mit den neurotrophen Eigenschaften von CDNF in
vitro. Nach erfolgreicher Protektion sollte durch molekulare und biochemische Methoden der
unbekannte Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von CDNF nÀher untersucht
werden. Verschiedene neuronale Zellkulturen wurden dafĂŒr mit 6-Hydroxydopamin oder
Glutamat geschÀdigt. Rekombinant hergestelltes CDNF oder dessen SAPLIP-DomÀne
wurden extern zugefĂŒhrt und der Einfluss der zugesetzten Proteine analysiert. Im Gegensatz
zu den vorherigen Ergebnissen in vivo, konnte in keinem der verwendeten in vitro Systeme
eine signifikante Protektion oder Proliferation durch CDNF beobachtet werden
Isolierung und Charakterisierung der hÀmatopoietischen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut beim Rind (Bos taurus)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die hĂ€matopoietischen Zellen des bovinen Nabelschnurblutes und insbesondere die HSC(hĂ€matopoietische Stammzellen)zu charakterisieren. Hierzu wurden Proben aus dem Nabelblut von bovinen Feten der SSL 3,4 cm bis 94 cm und von KĂ€lbern unmittelbar nach der Geburt gewonnen und mit Ammoniumchlorid-Lysispuffer und FicollÂź aufgereinigt. Zur Charakterisierung der einzelnen Zellen wurden lichtmikroskopische, immunhistochemische, glykohistochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgefĂŒhrt
Mechanistical investigations of the modulation of cytosolic phospholipase A2 by hyperforin
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von ArachidonsĂ€ure (AA) fĂŒr die Produktion von entzĂŒndungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine SchlĂŒsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzĂŒndlichen Wirkspektrum von Hyperforin beitrĂ€gt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfĂ€ltige Art und Weise in EntzĂŒndungsprozesse ein und hemmt unter anderem die AktivitĂ€t der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprĂŒchliche Ergebnisse. WĂ€hrend in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrĂŒckt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 ”M), konnte Hyperforin die cPLA2-AktivitĂ€t in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeintrĂ€chtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 ”M Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensĂ€ure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprĂŒchlichen Befunde fĂŒhrten zu nĂ€heren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine BeeintrĂ€chtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 ”M) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulĂ€rem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenĂŒber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 ”M, 7,6 ”M, 5,5 ”M und 4,4 ”M). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 ”M Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenĂŒber dem PAPE-Substrat verstĂ€rkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der MembranoberflĂ€che und âstruktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate fĂŒr die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. DarĂŒber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen CarbonsĂ€urestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhĂ€ngig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-AktivitĂ€t wurde auch die Dichte der Liposomen abhĂ€ngig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Ănderungen der Membrandichte nicht mit EinflĂŒssen auf die EnzymaktivitĂ€t korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, UniversitĂ€t Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe ZusammenhĂ€nge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zellulĂ€re Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulĂ€ren Signaltransduktionswege zelltypabhĂ€ngig die cPLA2-AktivitĂ€t modulieren.The cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) is a key enzyme in the liberation of arachidonic acid (AA) for the generation of eicosanoids and lysophospholipids. In this study the role of cPLA2 for the anti-inflammatory effects of hyperforin is investigated. Hyperforin is an important and pharmacological relevant ingredient of St. Johnâs wart and inhibits inflammatory processes as the activation of 5-lipoxygenase and cyclooxygenase-1. Here, the influences of hyperforin on cPLA2 were studied in human polymorphonuclear leukocytes (PMNL) and platelets. The observed effects were contradictory and cell type specific. While hyperforin potently blocked the A23187- and thapsigargin-induced release of AA in PMNL (IC50 = 1.5 â 1.9 ”M) it could not diminish the A23187-induced activation of cPLA2 in platelets and only slightly inhibit the release of AA from platelets challenged by thrombin. On the other hand, challenge of platelets by 10 ”M hyperforin resulted in the translocation of cPLA2 to the plasma membrane, the release of AA and consequently the generation of 12-hydro(pero)xyeicosatetraenoic acid (12-H(P)ETE). Direct incubation of PMNL with hyperforin was without any effects. Activation of cPLA2 was reported to be addicted to alterations of the intracellular Ca2+-level as well as to the phosphorylation of cPLA2 by mitogen activated proteinkinases (MAPK). However, effects of hyperforin were found to be independent on these intracellular signaling pathways. As reported, hyperforin fails to inhibit A23187- and thapsigargin-induced Ca2+ influx in PMNL and furthermore hyperforin up to 10 ”M could not diminish the activation of relevant MAPK in those cells. In platelets deletion of extra- and intracellular Ca2+ as well as the inhibiton of MAPK and thereby the prevention of phosphorylation of cPLA2 could not inhibit the hyperforin induced effects on the translocation of cPLA2 as well as the release of AA and 12-H(P)ETE. In cell free investigations hyperforin failed to alter the release of AA from liposomes of 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC). However, if dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol or cholesterol were integrated into PAPC-liposomes or if liposomes with lipid raft structures were constructed (PAPC/sphingomyelin/cholestero 1:1:1) hyperforin inhibited the activity of cPLA2 (IC50 = 13.2 ”M, 7.6 ”M, 5.5 ”M and 4.4 ”M) in the presence of Ca2+. In the absence of Ca2+ hyperforin increased the release of AA from PAPC-liposomes with cholesterol, liposomes with lipid raft structures and liposomes of 1-plamitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin (PAPE) 3.3 to 7.3fold. Further, hyperforin enhanced the binding of cPLA2 to liposomes with cholesterol or lipid raft structures but not to vesicles of PAPE. The observed effects could not be reproduced in triton-X-100 micelles, indicating the importance of specific membrane structures for the effects of hyperforin. Additionally, the vinylogous carbonic acid structure of hyperforin was found to be essential. O-Methylhyperforin failed to inhibit the release of AA from PMNL and to enhance the activity of cPLA2 in platelets and induced an unspecific activation of cPLA2 in cell free investigations that was independent on the composition of membranes. Beside cPLA2 activity hyperforin further modulated the rigidity of liposomes dependent on the composition of the lipid aggregates. However, no correlation between the effects of hyperforin on membrane rigidity and enzyme activity could be drawn. In cooperation with the group of Prof. Glaubitz, university of Frankfurt, the incorporation of hyperforin in liposomes of 1-palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin was studied by 1H-MAS-NMR-NOESY. This way the oxygen rich bicyclus of hyperforin was found to locate near the phospholipid headgroups of lipids while the isoprenyl groups penetrated into the hydrophobic core of the bilayer. Taken together, the results of this work in intact cells and cell free assays indicate a complex way of mechanisms of hyperforin which differentially modulates cPLA2 activity in PMNL and platelets independently on intracellular signalling pathways or direct enzyme regulation. Rather, the unspecific insertion of hyperforin into phoshpolipid bilayers of specific structures results in alterations of the activity of cPLA2 and may be responsible for the observed modulation of AA release in PMNL and platelets
Isolierung und Charakterisierung der hÀmatopoietischen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut beim Rind (Bos taurus)
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die hĂ€matopoietischen Zellen des bovinen Nabelschnurblutes und insbesondere die HSC(hĂ€matopoietische Stammzellen)zu charakterisieren. Hierzu wurden Proben aus dem Nabelblut von bovinen Feten der SSL 3,4 cm bis 94 cm und von KĂ€lbern unmittelbar nach der Geburt gewonnen und mit Ammoniumchlorid-Lysispuffer und FicollÂź aufgereinigt. Zur Charakterisierung der einzelnen Zellen wurden lichtmikroskopische, immunhistochemische, glykohistochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen durchgefĂŒhrt
Der Stoffwechsel der Sphingolipide : Einfluss von Substratanaloga der Dihydroceramid-Desaturase auf den Sphingolipidstoffwechsel humaner Keratinozyten und Untersuchungen zum Lipidstoffwechsel bei SpinocerebellÀrer Ataxie Typ 2
Die Dihydroceramid-4-Desaturase ist ein membrangebundenes Enzym höherer Eukaryonten, das auf der zytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Sie katalysiert mit der EinfĂŒhrung der 4,5-(E)-Doppelbindung in das Sphingoid-RĂŒckgrat den letzten Schritt der Ceramid-Biosynthese. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss zweier Substratanaloga der Dihydroceramid-4-Desaturase auf den Sphingolipidstoffwechsel humaner Keratinozyten untersucht. Bei den beiden Verbindungen handelte es sich um modifizierte Dihydroceramide mit einem Cyclopropyl-Rest (Cp-DHC) bzw. einer Dreifachbindung (Db-DHC) zwischen den Positionen 5 und 6 der Sphingoidbase. Nach enzymatischer Bildung eines Radikals in Position 4 und Umlagerung der reaktiven Zwischenstufe ist die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Cp-DHC bzw. Db-DHC und der Dihydroceramid-4-Desaturase und damit eine Hemmung des Enzyms denkbar. ZunĂ€chst wurden metabolische Markierungsstudien mit L-[3-14C]-Serin, dem radioaktiv markierten AusgangsmolekĂŒl der Ceramid-Biosynthese, und radiomarkierten zellgĂ€ngigen Analoga von Dihydroceramid und Ceramid unter Zusatz verschiedener Konzentrationen Cp-DHC und Db-DHC an differenzierten Keratinozyten durchgefĂŒhrt. Dabei konnte eine von der Konzentration der beiden Verbindungen abhĂ€ngige Zunahme des Dihydroceramid- und eine Abnahme des Ceramidanteils nachgewiesen werden. Dieser Befund spricht fĂŒr eine Inhibierung der Dihydroceramid-4-Desaturase. Bei der [3-14C]-Serin-Markierung differenzierter Keratinozyten zeigte sich in Gegenwart von Cp-DHC bzw. Db-DHC zudem eine Erhöhung der Menge biosynthetisierten Phytoceramids. AuĂerdem wurden als Stoffwechselprodukte von Cp-DHC und Db-DHC Sphingomyelin-Analoga und mit verschiedenen endogenen FettsĂ€ure acylierte N-Acyl-Metabolite massenspektrometrisch identifiziert. Im Gegensatz zu Ceramid ruft Dihydroceramid in der Regel keine antimitogenen Effekte hervor. Daher wurde untersucht, welche Konsequenzen die durch Cp-DHC hervorgerufene Abnahme des Ceramid- zugunsten des Dihydroceramidanteils auf den Ăbergang von Proliferation zu Differenzierung in humanen Keratinozyten hat. Dazu wurde die Expression von Genen einiger Proteine, die am Ceramidstoffwechsel und an der Differenzierung von Keratinozyten beteiligt sind, mittels real-time Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Dabei zeigte sich, dass wĂ€hrend der durch 1.1 mM Ca2+ und 10 ”M LinolsĂ€ure induzierten Differenzierung der Keratinozyten in Gegenwart von Cp-DHC die Expressionsraten von Differenzierungsmarkerproteinen herunter- und die eines Proliferationsmarkers hochreguliert wurde. AuĂerdem fĂŒhrte der Zusatz von Cp-DHC zu einer Hochregulierung der Expressionsrate aller untersuchten Ceramid-metabolisierenden Enzyme, wodurch der Zellstoffwechsel in Richtung einer vermehrten Bildung von Sphingosin dirigiert wurde, das nach Phosphorylierung mitogene Effekte vermittelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Mangel an 4,5-ungesĂ€ttigten Sphingolipiden zu einer Störung der Differenzierung fĂŒhrt, die zur Folge hat, dass die Keratinozyten in einem proliferierenden Zustand verbleiben. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur SpinocerebellĂ€rer Ataxie Typ 2 (SCA2) durchgefĂŒhrt. SCA2 gehört zur Gruppe der neurodegenerativen Polyglutaminkrankheiten. Das bei SCA2 betroffene Protein Ataxin-2 wird ubiquitĂ€r exprimiert. Seine Funktion und der zur Erkrankung fĂŒhrende Pathomechanismus sind unbekannt. Da sich in jĂŒngerer Zeit die Hinweise mehren, dass Polyglutaminkrankheiten mit Störungen des Lipidstoffwechsels verbunden sind, wurde die Lipidzusammensetzung in Hirngewebe einer SCA2-Patientin analysiert. Dazu wurden Proben aus dem Cortex, der bei SCA2 weitgehend erhalten bleibt, und aus dem Kleinhirn, das von der Krankheit hauptsĂ€chlich betroffen ist, untersucht. Dabei ergab sich als wichtigstes Ergebnis ein starker Mangel an Lipiden, die typischerweise im Myelin vorkommen, im Kleinhirn der Patientin. Nur unwesentlich verĂ€ndert war dagegen der Gehalt an Gangliosiden, die nur in geringen Konzentrationen im Myelin, sondern hauptsĂ€chlich in der neuronalen Plasmamembran und damit in der grauen Hirnsubstanz zu finden sind. Die Ergebnisse sind Zeichen einer Demyelinisierung im Kleinhirn der Patientin. WĂ€hrend SCA2-Patienten u. a. an einer starken Reduktion des Unterhautfettgewebes leiden, zeigen drei Monate alte SCA2-knock out-MĂ€use Fettleibigkeit und Insulinresistenz. Dies weist darauf hin, dass Ataxin-2 eine regulierende Funktion in den durch Insulin vermittelten Signalwegen haben könnte. Zur KlĂ€rung der Frage, ob die fĂŒr SCA2 verantwortliche Expansion des Polyglutaminstrangs in Ataxin-2 zu einem Funktionsverlust des Proteins fĂŒhrt, wurden die Lipidzusammensetzung in Cortex und Kleinhirn der knock out-MĂ€use analysiert. Dabei zeigte sich im Kleinhirn der knock out-MĂ€use kein Mangel Myelin-typischer Lipide, sondern im wesentlichen ein deutlich erhöhter Gangliosidgehalt. Der Verlust von Ataxin-2 in MĂ€usen fĂŒhrt also nicht zu den gleichen LipidverĂ€nderungen im Gehirn wie die Existenz von variantem Ataxin-2 mit expandierter Polyglutaminkette in SCA2-Patienten. Da jedoch erhöhte Konzentrationen von Ceramid oder höheren Sphingolipiden in verschiedenen Geweben hĂ€ufig mit der Vermittlung von Insulinresistenz in Zusammenhang stehen, bekrĂ€ftigen die im Kleinhirn der SCA2-knock out-MĂ€use gefunden erhöhten Gangliosidmengen das Bild von Ataxin-2 als einen Regulator der durch Insulin vermittelten Signalwege