A Computational Chemistry Approach for the Catalytic Cycle of AHAS

Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiamin diphosphate (ThDP)-dependent enzyme involved in the biosynthesis of branched-chain amino acids (valine, leucine, and isoleucine) in plants, bacteria, and fungi. This makes AHAS an attractive target for herbicides and bactericides, which act by interrupting the catalytic cycle and preventing the synthesis of acetolactate and 2-keto-hydroxybutyrate intermediates, in the biosynthetic pathway toward the synthesis of branched amino acids, causing the death of the organism. Several articles on the catalytic cycle of AHAS have been published in the literature; however, there are certain aspects, which continue being controversial or unknown. This lack of information at the molecular level makes difficult the rational development of novel herbicides and bactericides, which act inhibiting this enzyme. In this chapter, we review the results from our group for the different stages of the catalytic cycle of AHAS, using both quantum chemical cluster and Quantum Mechanics/Molecular Mechanics approaches

A Theoretical Study of the Benzoylformate Decarboxylase Reaction Mechanism

Density functional theory calculations are used to investigate the detailed reaction mechanism of benzoylformate decarboxylase, a thiamin diphosphate (ThDP)-dependent enzyme that catalyzes the nonoxidative decarboxylation of benzoylformate yielding benzaldehyde and carbon dioxide. A large model of the active site is constructed on the basis of the X-ray structure, and it is used to characterize the involved intermediates and transition states and evaluate their energies. There is generally good agreement between the calculations and available experimental data. The roles of the various active site residues are discussed and the results are compared to mutagenesis experiments. Importantly, the calculations identify off-cycle intermediate species of the ThDP cofactor that can have implications on the kinetics of the reaction

Design, synthesis and structural characterisation of inhibitors of 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate Synthase

Due to the emergence of pathogenic organisms with resistance to classical antibiotics, the developmemt of new drugs is needed. The enzyme 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXPS) is a potential target for such a new antibiotic. DXPS is the first enzyme of the methylerythritol phosphate (MEP) pathway, one of two known pathways for the biosynthesis of essential terpene building-blocks. It is found in many bacteria and plants, whereas most other organisms, especially mammals, use the mevalonate pathway. Inhibition of the MEP pathway is therefore one way to impare the growth and survival of microorganisms. The focus of this thesis is the protein structure of DXPS and the identification and development of DXPS inhibitors. In Chapter 1.2 an overview of the enzyme and the metabolic pathway is given, Chapter 1.3 updates on developments since 2017. Chapter 1.4 introduces our general workflow for protein-templated dynamic combinatorial chemistry (ptDCC). The main part describes in Chapters 2.1 and 2.2 protein crystallographic work to improve the resolution of D. radiodurans DXPS and structural elucidation of DXPS homologous from pathogenic species. In parallel, the hit-identification strategies ligandbased virtual screening (Chapter 2.3) and ptDCC (Chapter 2.4) were applied to find DXPS inhibitors. Finally, Chapter 2.5 describes the development and crystallographic validation of bioisosters for acylhydrazone-based ptDCC hits.Aufgrund der Zunahme von antibiotika-resistenten Pathogenen ist die Entwicklung neuer Antibiotika erforderlich. Das Enzym 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (DXPS) ist ein potenzielles Ziel für eine solche Neuentwicklung. DXPS ist das erste Enzym des Methylerythritolphosphat (MEP)-Weges, einer von zwei Stoffwechselwegen für die Biosynthese der essentiellen Terpen bausteine. Er kommt in vielen Bakterien und Pflanzen vor, wohingegen die meisten anderen Organismen, insbesondere Säugetiere, den Mevalonatweg nutzen. Die Hemmung des MEP-Weges ist daher eine Möglichkeit, das Wachstum und Überleben von Mikroorganismen gezielt zu beeinträchtigen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Proteinstruktur von DXPS sowie der Identifizierung und Entwicklung von DXPS-Inhibitoren. Zunächst wird ein Überblick über das Enzym, den MEP-Weg und den aktuellen Forschungsstand seit 2017 gegeben (Kapitel 1.2 und 1.3). Das Protokoll unserer Arbeitsgruppe für protein-templierte dynamische kombinatorische Chemie (ptDCC) wird anschließend in Kapitel 1.4 vorgestellt. Der Hauptteil beschriebt in den Kapiteln 2.1 und 2.2 proteinkristallographische Arbeiten zur Verbesserung der Auflösung von D. radiodurans DXPS sowie zur Strukturaufklärung von DXPS-homologen von Pathogenen. Parallel dazu wurden die Hit-identifikations- Strategien ligandenbasiertes virtuelles Screening (Kapitel 2.3) und ptDCC (Kapitel 2.4) angewandt, um DXPS-Inhibitoren zu finden. Abschließend wird in Kapitel 2.5 die Entwicklung und kristallographische Validierung von Bioisosteren für Acylhydrazon-basierte ptDCC-Hits beschrieben.LIFT gran

Systematische Analyse der Sequenz-Struktur-Funktions Zusammenhänge bei Thiamindiphosphat-abhängigen Enzymen

Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes form a vast and diverse protein family, both in the sequence space and in their functional potential. Of particular interest are the enantioselective C-C bond forming and cleavage reactions catalyzed by those enzymes. In these reaction, different ThDP-dependent enzymes provide distinct enantio- and chemoselectivities with often narrow substrate and product ranges. This specificity, which is beneficial for the enantiopure synthesis of fine chemicals like 2-hydroxy ketones, limits the scope of accessible products. Investigations of crystal structures of different ThDP-dependent decarboxylases revealed steric properties in the active sites of those enzymes to control the enantio- and chemoselectivity (S-pocket and donor-acceptor concept). Subsequent application of those concepts by modulation of the steric properties of enzymes’ active sites enabled rational engineering of biocatalysts with desired, but often only moderate, non-physiological enantioselectivities. The major objective of this thesis was to systematically analyze the sequences and structures of this enzyme family and to elucidate the relationships between sequence, structure and function. Detailed understanding of those relationships is pivotal for rational engineering and therefore necessary for the design of biocatalysts with desired selectivities. As compared to the enormous size of this enzyme family only a small number of representatives were experimentally characterized. Even less ThDP-dependent enzymes were modified by mutations in order to analyze effects of distinct amino acid residues and still less were structurally determined. Since the systematic analysis of the sequence-structure-function relationships requires information on the structure and function of a major fraction of family members, methods were developed and applied to increase the amount of available structure and function information. By making use of homology modeling, putative atom coordinates for enzymes lacking experimentally determined structure information were predicted. In addition, by development of a new database system that combines sequence, structure and function information, the acquisition of accurate and comparable biochemical data unambiguously linked to the biocatalysts’ amino acid sequences was enabled. Comparability of biochemical data and deduction of functional roles of certain residues requires comparable biochemical data on the one hand and methods to compare residues from different enzymes on the other hand. Introduction of standard numbering schemes for ThDP-dependent enzymes facilitated fast and accurate comparison of structurally equivalent positions without the need for structure information. The findings derived from those analyses accelerated the engineering of enzymes with desired enantio- and chemoselectivities and inter alia enabled the enzymatic, direct asymmetric synthesis of (S)-benzoins with excellent ees.Die Familie der Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängigen Enzyme ist gleichermaßen sequenziell als auch funktionell vielfältig. Besonderes Interesse wird dieser Familie aufgrund ihrer Fähigkeit zuteil, C-C Bindungs- und Spaltungsreaktionen zu katalysieren. Für einen Einsatz in der Biokatalyse und der Synthese von Feinchemikalien (wie beispielsweise alpha-Hydroxyketone) zeichnen sie sich zudem durch ihre definierten Substratspektren als auch ihre Enantioselektivität in zahlreichen Reaktionen aus. Allerdings schränken diese Spezifitäten das Spektrum an enzymatisch zugänglichen Produkten ein. Vergleichende Untersuchungen vorhandener Proteinstrukturen verschiedener ThDP-abhängiger Enzyme zeigten Unterschiede in der Form der Substrat-Bindetaschen der unterschiedlichen Vertreter. Die daraus abgeleiteten ’S-pocket’- und ’Donor/Akzeptor’-Konzepte führen diese sterischen Unterschiede und die resultierenden verschiedenen räumlichen Anordnungen der beiden Substrate in Ligationsreaktionen als die Ursache verschiedener Enantio- und Substratpräferenzen an. Auf dieser Grundlage konnten, durch Anpassung der Form der aktiven Taschen, Decarboxylasen mit geänderten Selektivitäten erzeugt werden. Oft allerdings einhergehend mit nur moderaten Stereoselektivitäten in der Katalyse nicht-natürlicher Reaktionen. Für den Erfolg von Rationalem Design von Biokatalysatoren mit gewünschten Eigenschaften sind detaillierte Kenntnisse über die Sequenz-Struktur-Funktions Zusammenhänge der jeweiligen Proteinfamilie von Bedeutung. Diese Doktorarbeit hatte die systematische Analyse dieser Zusammenhänge in ThDP-abhängigen Enzymen zum Ziel. Eine systematische Analyse von Sequenz-Struktur-Funktions Zusammenhängen erfordert implizit Sequenz-, Struktur- und Funktionsinformation für einen Großteil der zur Familie gehörenden Enzyme. In bisherigen Arbeiten wurden - relativ zu den enormen Ausmaßen dieser Proteinfamilie - nur wenige Vertreter experimentell charakterisiert. Für weiterführende Untersuchungen bezüglich des Einflusses bestimmter Aminosäure-Positionen auf die katalytische Aktivität oder Selektivität wurden nochmals nur wenige dieser Enzyme herangezogen. Eine experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur, welche für Rationales Design von Biokatalysatoren von besonderer Bedeutung ist, wurde nur für einen noch geringeren Bruchteil der ThDP-abhängigen Enzyme durchgeführt. Um dem bestehenden Mangel an Informationen über die Struktur und Funktion von Enzymen zu begegnen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteinstrukturen per Homologie-Modellierung vorhergesagt und Methoden zur Erfassung und Auswertung von Funktionsdaten entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen Datenbank-Systems zur Erfassung verlässlicher und vergleichbarer Daten über die Funktion und Sequenz von Enzymen, wurde die Basis für eine systematische Analyse der genannten Zusammenhänge geschaffen. Neben der Verfügbarkeit von Funktionsinformation, eindeutig mit der Sequenz des entsprechenden Enzyms verknüpft, erfordert die systematische Analyse möglicher funktioneller Bedeutungen einzelner Aminosäure-Positionen eine Methode zum Vergleich von Aminosäuren aus verschiedenen Enzymen. Eine solche Methode wurde mit dem hier präsentierten ’standard numbering scheme’ (Standard-Nummerierungs System) zur Verfügung gestellt. Die Anwendung dieser Methode erlaubt die schnelle und akkurate Identifikation strukturell äquivalenter Positionen in verschiedenen Enzymen ohne Abhängigkeit von Strukturinformation zu den jeweils analysierten Proteinen. Die aus diesen Analysen gezogenen Erkenntnisse wurden eingesetzt, um Biokatalysatoren mit gewünschten Enantio- und Chemoselektivitäten zu erzeugen und erstmals die enzymatische, direkte asymmetrische Synthese von (S)-Benzoinen zu ermöglichen