Charakterisierung der Interaktion zwischen Stuhlmikrobiom und autosomal dominanter polyzystischer Nierenerkrankung (ADPKD)

Die autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (APDKD) ist die häufigste vererbbare chronische Nierenerkrankung1,2. Der unvermeidliche Progress der Erkrankung mit zunehmendem Nierenfunktionsverlust, chronisch, rekurrierenden Schmerzen sowie die potenzielle Übertragung auf Nachkommen stellt für die Betroffenen und ihre Familien eine immense Belastung dar. Eine Identifikation der Einflussfaktoren, welche eine rasche Erkrankungsprogression begünstigen und gegebenenfalls therapeutisch modulierbar sind, ist ein wichtiges Forschungsziel im Feld. Hierbei ist das intestinale Mikrobiom eines der vielversprechendsten neuen Gebiete. Kulturunabhängige Charakterisierungen gewähren mittlerweile einen Einblick in die enorme Diversität, funktionelle Kapazität sowie die durch natürliche Faktoren oder Krankheit bedingte Dynamik des intestinalen Mikrobioms3. Insbesondere Produkte des bakteriellen Metabolismus gewinnen durch ihre gesundheitsförderlichen, als auch schädlichen Effekte zunehmend an Aufmerksamkeit. Diese Arbeit charakterisiert als Pilotstudie das intestinale Mikrobiom sowie Metabolite des bakteriellen Stoffwechsels bei ADPKD-Patient*innen. In den Analysen des Stuhlmikrobioms von Patient*innen mit einer ADPKD, konnten spezifische Veränderungen gefunden werden, die mit nachteiligen Effekten auf die Gesundheit des Wirts assoziiert sind (Enterobacterales, Enterobacteriaceae). Gleichzeitig fand sich eine reduzierte Anzahl von Mikrobiota, die mit vorteilhaften Auswirkungen auf ihren Wirt assoziiert sind (Bifidobacterales, Bifidobacteriaceae). Patient*innen mit einer ADPKD und einem früh aufgetretenem arteriellen Hypertonus wiesen zudem eine Zunahme, überwiegend gesundheitsschädlicher Mikroorganismen (Phylum Proteobacteria) und eine Reduktion der Gesundheit zuträglicher Tannerellaceae auf. Alle untersuchten Urämietoxine (UT) wiesen einen inversen Zusammenhang zur Nierenfunktion auf. Hinsichtlich möglicher Assoziationen der UT, mit den in den Subgruppenanalysen identifizierten abundanten Taxa, konnte nur für die Familie der Peptococcaceae eine direkte Verbindung zu den Serumkonzentrationen des Indoxylsulfats (IS) hergestellt werden. Bislang findet sich nur eine Studie mit Bezug zum intestinalen Mikrobiom bei ADPKD4. In dem hier dargestellten Projekt konnten bereits viele Überschneidungen gefunden werden, sodass ADPKD spezifische Veränderungen des intestinalen Mikrobioms hochwahrscheinlich sind. Hinsichtlich eines Einflusses intestinal gebildeter UT, findet sich zum aktuellen Zeitpunkt keine Studie an Menschen mit einer ADPKD. Vor dem Hintergrund der kleinen Kohorte lassen sich aus dieser Arbeit keine endgültigen, kausalen Schlüsse ableiten. Weiteren Studien des intestinalen Mikrobioms unter Einbeziehung intestinal gebildeter UT kommt nun eine herausragende Bedeutung zu, um Kausalitäten in der Pathogenese der ADPKD und etwaige Einfluss nehmende Faktoren festzustellen. Diese Arbeit stellt eine entsprechende Grundlage zur Verfügung

Haplotyp-spezifische Deletionen am Genort des Morbus Best mittels CRISPR/Cas9 Genom-Editierung

Bei der Best`schen vitelliformen Makuladystrophie (BVMD) oder auch Morbus Best (M. Best) handelt es sich um eine autosomal dominant vererbte Makulopathie, von der primär die Zellen des retinalen Pigmentepithels (RPE) betroffen sind. Bis heute sind mehr als 200 verschiedene Mutationen im Bestrophin 1 (BEST1) Gen bekannt, welche zu einer Funktionsbeeinträchtigung des BEST1 Proteins als Volumen-gesteuerter Kalzium-abhängiger Chlorid-Kanal in der basolateralen Membran der RPE Zellen führen. BVMD-assoziierte Mutationen üben einen dominant negativen Effekt auf das wildtypische Allel aus. Vermutlich führt schon der Einbau einer einzigen mutierten Proteinuntereinheit in die homo-pentamere BEST1 Kanalstruktur zu einer Beeinträchtigung des Chloridtransports. Der therapeutische Ansatz dieser Arbeit zielt daher auf eine Reduktion mutierter Untereinheiten auf genomischer Ebene ab, welcher als mutationsunabhängiger Ansatz über die CRISPR/Cas9 Methode verfolgt werden soll. Anstatt der jeweils Krankheits-verursachenden Mutation, werden häufig vorkommende Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) am BEST1-Genort targetiert, die sich in cis auf dem Mutations-tragenden DNA-Strang befinden. Dafür wurden zunächst bioinformatisch SNP-spezifische single guide RNAs (sgRNAs) entworfen. Für die Erkennung der DNA durch den CRISPR/Cas-Komplex ist eine kurze Basensequenz in der DNA, die sogenannte Protospacer Adjacent Motiv (PAM) Sequenz notwendig. Indem die sgRNA an die komplementäre Ziel-DNA bindet, wird die Cas9-Endonuklease spezifisch an den mutationstragenden Haplotypen herangeführt, wo dieser Komplex Doppelstrangbrüche (DSB) verursacht. Durch die Fehleranfälligkeit der nicht-homologen Endreparatur (non-homologous end joining, NHEJ) entstehen Insertionen und Deletionen, die zu der Entstehung frühzeitiger Stopcodons und zu einem Abbruch der Gentranslation führen. Das Wildtyp-Allel, welches sich an der Position des SNPs von dem mutierten Allel unterscheidet, sollte von der Mutations-abhängigen sgRNA nicht beeinflusst werden. Dadurch sollte weiterhin funktionsfähiges Protein exprimiert werden, wenn auch nur haploinsuffizient. Damit sollte wieder ein funktionsfähiger pentamerer BEST1-Chloridkanal generiert werden. Für die Allel-spezifische Genomeditierung wurden zunächst Transfektionsexperimente in HEK293T-Zellen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die experimentellen Evidenzen nur ungenügend mit den durch die Software errechneten Vorhersagewerten für eine hohe Effizienz und Spezifität der sgRNAs übereinstimmten. Daher wurde die Allelspezifität der sgRNAs mittels Sequenzverkürzungen und dem Austausch einzelner Nukleotide in der sgRNA-Sequenz entgegen zu wirken. Dieser Optimierungsprozess konnte für alle untersuchten sgRNAs eine deutliche Verbesserung der Allelspezifität erreichen. Dabei konnte festgestellt werden, dass Modifikationen am 5`-Ende der sgRNA deutlich besser toleriert werden als in den zur PAM-Sequenz angrenzenden 8-12 Nukleotiden einer sgRNA, der sogenannten „Seed“-Region. Allerdings gelang es trotz zahlreicher Versuche nicht, allgemein gültige Aussagen über den Erfolg der Optimierungsansätze zu treffen, da abhängig von der Ziel- und sgRNA-Sequenz jeweils unterschiedliche Modifikationen zum optimalen Ergebnis führten. In einem finalen Schritt wurde das Ausmaß der tatsächlich stattgefundenen Haplotypdeletionen in primären Fibroblasten-Zelllinien an definierten Haplotypen von BVMD-Patienten getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die optimierten sgRNAs an den heterozygoten Genloci eine durchweg sehr gute Spezifität für den mutationstragenden DNA-Strang zeigten. Entsprechend wurde das wildtypische Allel in keinem der untersuchten Fälle vom CRISPR/Cas9-System erkannt und modifiziert. Allerdings waren die Effizienzen der sgRNAs, DSBs in der Ziel-DNA zu erzeugen, sehr unterschiedlich und korrelierten selten mit den bioinformatischen Berechnungen oder den Vorexperimenten in den HEK293T-Zellen. Für eine genaue Bestimmung der Effizienzen war daher die jeweilige experimentelle Austestung der einzelnen sgRNAs und/oder deren Kombination in den Patienten-Fibroblasten-Zelllinien erforderlich

Dynamik und Wirkung der microRNA-Expression in der frühen Phase der humanen CD4+ T-Zell-Aktivierung

T-Zellen spielen eine unverzichtbare Rolle im Rahmen der adaptiven Immunabwehr (JANEWAY et al., 1975; MATTER, 1974; ZHU, 2018). Eine veränderte T-Zell-Aktivität wird im Zusammenhang mit der Entstehung verschiedener schwerwiegender Erkrankungen diskutiert (CHEN, JOHN WHERRY, 2020; DORNMAIR et al., 2003; MOLON et al., 2016; TAN et al., 2020). Für die Regulation der T-Zell-Aktivierung scheint die Expression von microRNAs von zentraler Bedeutung zu sein (EICHMULLER et al., 2017; KOPP et al., 2013; LIU et al., 2013b; LORENZI et al., 2012). Als Biomarker für T-Zell gekoppelte Erkrankungen und als Instrument für die gezielten Manipulation der T-Zell-Funktion könnten microRNAs in Zukunft im diagnostischen und therapeutischen Bereich Anwendungen finden (COLAMATTEO et al., 2019; LONG et al., 2018). Umfangreiche Kenntnisse zur Expression und zur spezifischen Wirkungsweise von microRNAs sind dafür eine wesentliche Voraussetzung (EICHMULLER et al., 2017; GIRI et al., 2019; JI et al., 2016; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). Die Ziele dieser Arbeit bestanden in der Erfassung, Quantifizierung und funktionellen Charakterisierung von microRNA-Expressionsveränderungen in der frühen 24 h Phase der humanen T-Zell-Aktivierung. Die Studie wurde an CD4+ T-Zellen durchgeführt, die den größten Anteil der T-Zell-Subtypen im menschlichen Blut bilden und von zentraler Bedeutung für die Effektivität der Immunantwort sind (LUCKHEERAM et al., 2012; TOLLERUD et al., 1989). Als Ausgangspunkt der Analysen wurden detaillierte zeitaufgelöste Hochdurchsatz-Datensätze zur microRNA- und mRNA-Expression über die initialen 24 h der in vitro induzierten CD4+ T-Zell-Aktivierung erstellt. Auf Basis der umfassenden Zeitverlaufsdaten konnten 39 zentrale microRNAs mit deutlicher Expressionsveränderung im Kontext des T-Zell-Aktivierungsprozesses identifiziert werden. Hierbei konnte eine hohe technische und interindividuelle Reproduzierbarkeit der microRNA-Zeitverlaufsveränderungen gezeigt werden. Die Klassifizierung der zeitaufgelösten Expressionsprofile ermöglichte Rückschlüsse zu den Mechanismen, die zur Koordination der microRNA-Expression im Rahmen des frühen T-Zell-Aktivierungsprozesses beitragen könnten. Dazu zählt beispielsweise die Transkriptionskontrolle multipler microRNAs durch den Transkriptionsfaktor c-Myc. Durch die Etablierung einer neuen Methodik zur Quantifizierung der microRNA-Expression konnte ein grundlegender Überblick über die aktivierungs-gekoppelten Expressionsänderungen für alle 815 detektierten microRNAs gewonnen werden. Für die zentral veränderte miR-155-5p wurde ein molekularer microRNA-Expressionsbereich zwischen 7,54×104 und 3,25×106 Molekülen pro Nanogramm zellulärer Gesamt-RNA ermittelt. Im Hinblick auf eine zukünftige therapeutische microRNA-Nutzung konnte somit ein Rahmen für eine physiologisch angepasste Dosierung gelegt werden (LAI et al., 2019; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). Um Einblicke in die Wirkungsweise von microRNAs zu gewinnen, wurden die regulatorischen Funktionen der miR-155-5p untersucht, indem in silico vorhergesagte Zielgene mit invers korrelierenden mRNA-Zeitverlaufsdaten anhand von dualen Luciferase-Reporter-Assays getestet wurden. Dabei konnte die microRNA-Zielgen-Interaktion für 17 von 19 getesteten Genen bestätigt und der regulatorische Einfluss der microRNA für ein breites Spektrum zellulärer Funktionen gezeigt werden. Als Hinweis auf mögliche kooperative microRNA-Funktionen im Kontext des T-Zell-Aktivierungsprozesses konnten durch die in silico Analyse von microRNA-Zielgen-Netzwerken drei zentral veränderte microRNA-Paare mit multiplen gemeinsamen Zielgenen identifiziert werden (let-7b-5p/miR-26a-5p, miR-17-5p/miR-20a-5p und miR-21-5p/miR-155-5p). Exemplarisch für das miR-21-5p/miR-155-5p-Paar konnte im Rahmen von dualen Luciferase-Assays ein synergistischer regulatorischer Effekt auf das LEMD3-Zielgen nachgewiesen werden. Die Untersuchungen dieser Arbeit geben Einblicke in die Dynamik und Wirkung der microRNA-Expression im Kontext des frühen CD4+ T-Zell-Aktivierungsprozesses und liefern eine umfassende Datengrundlage zur Aufklärung von microRNA-regulierten Signalnetzwerken sowie für die Entwicklung von microRNA-basierten Therapieansätzen.T cells play an indispensable role for the adaptive immune defense (JANEWAY et al., 1975; MATTER, 1974; ZHU, 2018). An altered T cell activity is associated with the emergence of severe diseases (CHEN, JOHN WHERRY, 2020; DORNMAIR et al., 2003; MOLON et al., 2016; TAN et al., 2020). The expression of microRNAs appears to be critically important for the regulation of T cell activation (EICHMULLER et al., 2017; KOPP et al., 2013; LIU et al., 2013b; LORENZI et al., 2012). MicroRNAs bear high potential as future biomarkers for T cell related pathologies and as a tool for the targeted manipulation of T cells (COLAMATTEO et al., 2019; LONG et al., 2018). A fundamental understanding of the expression and functionality of microRNAs is a principal prerequisite to apply microRNAs in a future diagnostic and therapeutic context (EICHMULLER et al., 2017; GIRI et al., 2019; JI et al., 2016; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). The objectives of this thesis were the detection, quantification and functional characterization of microRNA expression changes within the early 24 h phase of human T cell activation. The study was conducted on CD4+ T cells, which constitute the largest fraction of T cell subtypes in human blood and are central to the effectiveness of the immune response (LUCKHEERAM et al., 2012; TOLLERUD et al., 1989). First, detailed time-resolved high-throughput datasets on microRNA and mRNA expression were determined during the initial 24 h of in vitro induced CD4+ T cell activation. Based on the comprehensive time-course data in context of the T cell activation process, 39 central microRNAs with distinct expression changes were identified and a very high technical and inter-individual reproducibility of the microRNA time-course changes was demonstrated. The classification of the time-resolved expression profiles allowed conclusions about the mechanisms that likely coordinate the microRNA expression during the early T cell activation process, as for example the transcriptional control of multiple microRNAs by the transcription factor c-Myc. A newly implemented methodology to quantify the microRNA expression allowed to determine both the molecular range of microRNA expression and the activation-coupled expression changes for all of the 815 detected microRNAs. For the most prominently changed miR-155-5p a microRNA expression range between 7.54×104 and 3.25×106 molecules per nanogram of cellular total RNA was determined. These quantitative data constitute a basis to define a physiological dosage for a future therapeutic application of microRNAs (LAI et al., 2019; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). To gain further insights into the functionality of microRNAs, regulatory functions of miR-155-5p were characterized by the testing of target genes that were in silico predicted and showed inverse correlating mRNA time-course data. Dual luciferase reporter assays confirmed microRNA target interactions for 17 out of the 19 tested genes. The regulatory microRNA impact was demonstrated on a broad range of cellular functions. In silico analyses of microRNA-target networks identified three prominently changed microRNA pairs with multiple shared targets (let-7b-5p/miR-26a-5p, miR-17-5p/miR-20a-5p and miR-21-5p/miR-155-5p), indicating presumable cooperative microRNA functions in the context of the T cell activation process. Exemplary for the miR-21-5p/miR-155-5p pair, dual luciferase assays demonstrated a synergistic regulatory effect on the LEMD3 target gene. This thesis provides insights into the dynamics and functionality of microRNA expression during the early CD4+ T cell activation process and a comprehensive data basis for both the elucidation of microRNA regulated signaling networks and the development of microRNA-based therapeutic approaches

Kartierung des HLA-Ligandoms der akuten myeloischen Leukämie zur Entwicklung einer therapeutischen Multipeptidvakzine

Zusammenfassung: Bahnbrechende Entwicklungen im Bereich der Immuntherapie (u.a. Checkpoint- Inhibitoren, CAR-T-Zellen) haben das (klinische) Potential einer T-Zell-basierten Therapie für eine effektive Malignombehandlung deutlich herausgestellt. Vor dem Hintergrund mäßiger 5-Jahresüberlebensraten im Rahmen der aktuellen Therapieoptionen, der erwiesenen Immunogenität dieser Erkrankung (u.a. im Rahmen der HSCT in Form des Graft-vs-Leukemia-Effekts), sowie des quantitativ günstigen Verhältnisses von Immuneffektor- zu Zielzellen nach Erreichen einer klinischen Remission erscheint eine Peptidvakzinierung ein attraktiver alternativer Behandlungsansatz für dieses Krankheitsbild. Auf der Grundlage genomischer Analysen und reverser Immunologie wurden bisher einige wenige AML-assoziierte Peptide beschrieben, deren klinische Effektivität jedoch bis dato nicht eindeutig gezeigt werden konnte. Für die Identifikation physiologisch relevanter Vakzinkandidaten wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein direkter Massenspektrometrie-basierter Analyseansatz des natürlich präsentierten HLA-Ligandoms gewählt. Die Kartierung des HLA-Klasse-I- Ligandomes von 15 AML Patienten und 35 gesunden Spendern ergab mehr als 25 000 verschiedene, natürlich präsentierte HLA-Peptide. Die Priorisierung der potentiellen Kandidaten erfolgte v.a. auf der Basis der AML-Exklusivität und einer hohen Präsentationsfrequenz in der AML-Kohorte. Eine Präsentation dieser Peptide konnte Subgruppen-übergreifend in mehr als 20 % der einzelnen AML-Patientenligandome nachgewiesen werden. Darüberhinaus konnten auch einige natürlich präsentierte HLA-Liganden bereits etablierter AML-assoziierter Antigene identifiziert werden. 80 % dieser Antigene wurden jedoch auch im HLA-Ligandom gesunder Spender detektiert. Im Zuge der HLA-Klasse-II-Ligandom-Kartierung von 12 AML-Patienten und 13 PBMC-Spendern wurden über 1000 verschiedene Quellproteine identifiziert. Ein Vergleich des HLA-exklusiven Quellproteoms beider Klassen ergab 43 gemeinsame Proteine, sowie drei HLA-Klasse-I-Liganden, deren Sequenz vollständig in ihren Klasse-II-Pendants enthalten war. Eine grob-orientierend durchgeführte, funktionelle Charakterisierung ausgewählter Peptidkandikaten beider HLA-Klassen lieferte erste Hinweise auf eine AML- spezifische Immunogenität einiger im Rahmen dieser Arbeit definierter Antigene

Personalisierte Medizin: Grundlagen für die interprofessionelle Aus-, Weiter- und Fortbildung von Gesundheitsfachleuten

Hinweise zur Ausarbeitung dieser Publikation: Die SAMW hat im Auftrag der Akademien der Wissenschaften Schweiz die thematische Plattform «Chancen und Risiken der Personalisierten Gesundheit» etabliert. In diesem Rahmen hat der SAMW-Vorstand eine Arbeitsgruppe beauftragt, das Thema der Aus-, Weiter- und Fortbildung von Gesundheitsfachleuten im Bereich «Personalisierte Medizin» zu bearbeiten