T-Zellen spielen eine unverzichtbare Rolle im Rahmen der adaptiven Immunabwehr (JANEWAY et al., 1975; MATTER, 1974; ZHU, 2018). Eine veränderte T-Zell-Aktivität wird im Zusammenhang mit der Entstehung verschiedener schwerwiegender Erkrankungen diskutiert (CHEN, JOHN WHERRY, 2020; DORNMAIR et al., 2003; MOLON et al., 2016; TAN et al., 2020). Für die Regulation der T-Zell-Aktivierung scheint die Expression von microRNAs von zentraler Bedeutung zu sein (EICHMULLER et al., 2017; KOPP et al., 2013; LIU et al., 2013b; LORENZI et al., 2012). Als Biomarker für T-Zell gekoppelte Erkrankungen und als Instrument für die gezielten Manipulation der T-Zell-Funktion könnten microRNAs in Zukunft im diagnostischen und therapeutischen Bereich Anwendungen finden (COLAMATTEO et al., 2019; LONG et al., 2018). Umfangreiche Kenntnisse zur Expression und zur spezifischen Wirkungsweise von microRNAs sind dafür eine wesentliche Voraussetzung (EICHMULLER et al., 2017; GIRI et al., 2019; JI et al., 2016; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). Die Ziele dieser Arbeit bestanden in der Erfassung, Quantifizierung und funktionellen Charakterisierung von microRNA-Expressionsveränderungen in der frühen 24 h Phase der humanen T-Zell-Aktivierung. Die Studie wurde an CD4+ T-Zellen durchgeführt, die den größten Anteil der T-Zell-Subtypen im menschlichen Blut bilden und von zentraler Bedeutung für die Effektivität der Immunantwort sind (LUCKHEERAM et al., 2012; TOLLERUD et al., 1989).
Als Ausgangspunkt der Analysen wurden detaillierte zeitaufgelöste Hochdurchsatz-Datensätze zur microRNA- und mRNA-Expression über die initialen 24 h der in vitro induzierten CD4+ T-Zell-Aktivierung erstellt. Auf Basis der umfassenden Zeitverlaufsdaten konnten 39 zentrale microRNAs mit deutlicher Expressionsveränderung im Kontext des T-Zell-Aktivierungsprozesses identifiziert werden. Hierbei konnte eine hohe technische und interindividuelle Reproduzierbarkeit der microRNA-Zeitverlaufsveränderungen gezeigt werden. Die Klassifizierung der zeitaufgelösten Expressionsprofile ermöglichte Rückschlüsse zu den Mechanismen, die zur Koordination der microRNA-Expression im Rahmen des frühen T-Zell-Aktivierungsprozesses beitragen könnten. Dazu zählt beispielsweise die Transkriptionskontrolle multipler microRNAs durch den Transkriptionsfaktor c-Myc.
Durch die Etablierung einer neuen Methodik zur Quantifizierung der microRNA-Expression konnte ein grundlegender Überblick über die aktivierungs-gekoppelten Expressionsänderungen für alle 815 detektierten microRNAs gewonnen werden. Für die zentral veränderte miR-155-5p wurde ein molekularer microRNA-Expressionsbereich zwischen 7,54×104 und 3,25×106 Molekülen pro Nanogramm zellulärer Gesamt-RNA ermittelt. Im Hinblick auf eine zukünftige therapeutische microRNA-Nutzung konnte somit ein Rahmen für eine physiologisch angepasste Dosierung gelegt werden (LAI et al., 2019; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017).
Um Einblicke in die Wirkungsweise von microRNAs zu gewinnen, wurden die regulatorischen Funktionen der miR-155-5p untersucht, indem in silico vorhergesagte Zielgene mit invers korrelierenden mRNA-Zeitverlaufsdaten anhand von dualen Luciferase-Reporter-Assays getestet wurden. Dabei konnte die microRNA-Zielgen-Interaktion für 17 von 19 getesteten Genen bestätigt und der regulatorische Einfluss der microRNA für ein breites Spektrum zellulärer Funktionen gezeigt werden. Als Hinweis auf mögliche kooperative microRNA-Funktionen im Kontext des T-Zell-Aktivierungsprozesses konnten durch die in silico Analyse von microRNA-Zielgen-Netzwerken drei zentral veränderte microRNA-Paare mit multiplen gemeinsamen Zielgenen identifiziert werden (let-7b-5p/miR-26a-5p, miR-17-5p/miR-20a-5p und miR-21-5p/miR-155-5p). Exemplarisch für das miR-21-5p/miR-155-5p-Paar konnte im Rahmen von dualen Luciferase-Assays ein synergistischer regulatorischer Effekt auf das LEMD3-Zielgen nachgewiesen werden.
Die Untersuchungen dieser Arbeit geben Einblicke in die Dynamik und Wirkung der microRNA-Expression im Kontext des frühen CD4+ T-Zell-Aktivierungsprozesses und liefern eine umfassende Datengrundlage zur Aufklärung von microRNA-regulierten Signalnetzwerken sowie für die Entwicklung von microRNA-basierten Therapieansätzen.T cells play an indispensable role for the adaptive immune defense (JANEWAY et al., 1975; MATTER, 1974; ZHU, 2018). An altered T cell activity is associated with the emergence of severe diseases (CHEN, JOHN WHERRY, 2020; DORNMAIR et al., 2003; MOLON et al., 2016; TAN et al., 2020). The expression of microRNAs appears to be critically important for the regulation of T cell activation (EICHMULLER et al., 2017; KOPP et al., 2013; LIU et al., 2013b; LORENZI et al., 2012). MicroRNAs bear high potential as future biomarkers for T cell related pathologies and as a tool for the targeted manipulation of T cells (COLAMATTEO et al., 2019; LONG et al., 2018). A fundamental understanding of the expression and functionality of microRNAs is a principal prerequisite to apply microRNAs in a future diagnostic and therapeutic context (EICHMULLER et al., 2017; GIRI et al., 2019; JI et al., 2016; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017). The objectives of this thesis were the detection, quantification and functional characterization of microRNA expression changes within the early 24 h phase of human T cell activation. The study was conducted on CD4+ T cells, which constitute the largest fraction of T cell subtypes in human blood and are central to the effectiveness of the immune response (LUCKHEERAM et al., 2012; TOLLERUD et al., 1989).
First, detailed time-resolved high-throughput datasets on microRNA and mRNA expression were determined during the initial 24 h of in vitro induced CD4+ T cell activation. Based on the comprehensive time-course data in context of the T cell activation process, 39 central microRNAs with distinct expression changes were identified and a very high technical and inter-individual reproducibility of the microRNA time-course changes was demonstrated. The classification of the time-resolved expression profiles allowed conclusions about the mechanisms that likely coordinate the microRNA expression during the early T cell activation process, as for example the transcriptional control of multiple microRNAs by the transcription factor c-Myc.
A newly implemented methodology to quantify the microRNA expression allowed to determine both the molecular range of microRNA expression and the activation-coupled expression changes for all of the 815 detected microRNAs. For the most prominently changed miR-155-5p a microRNA expression range between 7.54×104 and 3.25×106 molecules per nanogram of cellular total RNA was determined. These quantitative data constitute a basis to define a physiological dosage for a future therapeutic application of microRNAs (LAI et al., 2019; RUPAIMOOLE, SLACK, 2017).
To gain further insights into the functionality of microRNAs, regulatory functions of miR-155-5p were characterized by the testing of target genes that were in silico predicted and showed inverse correlating mRNA time-course data. Dual luciferase reporter assays confirmed microRNA target interactions for 17 out of the 19 tested genes. The regulatory microRNA impact was demonstrated on a broad range of cellular functions. In silico analyses of microRNA-target networks identified three prominently changed microRNA pairs with multiple shared targets (let-7b-5p/miR-26a-5p, miR-17-5p/miR-20a-5p and miR-21-5p/miR-155-5p), indicating presumable cooperative microRNA functions in the context of the T cell activation process. Exemplary for the miR-21-5p/miR-155-5p pair, dual luciferase assays demonstrated a synergistic regulatory effect on the LEMD3 target gene.
This thesis provides insights into the dynamics and functionality of microRNA expression during the early CD4+ T cell activation process and a comprehensive data basis for both the elucidation of microRNA regulated signaling networks and the development of microRNA-based therapeutic approaches
