Segmentation and supervised classification of image objects in Epo doping-control

Abstract A software system Gel Analysis System for Epo (GASepo) has been developed within an international WADA project. As recent WADA criteria of rEpo positivity are based on identification of each relevant object (band) in Epo images, development of suitable methods of image segmentation and object classification were needed for the GASepo system. In the paper we address two particular problems: segmentation of disrupted bands and classification of the segmented objects into three or two classes. A novel band projection operator is based on convenient object merging measures and their discrimination analysis using specifically generated training set of segmented objects. A weighted ranks classification method is proposed, which is new in the field of image classification. It is based on ranks of the values of a specific criterial function. The weighted ranks classifiers proposed in our paper have been evaluated on real samples of segmented objects of Epo images and compared t

Desarrollo de métodos moleculares para la detección de fraudes alimentarios.

Las fuertes crisis alimentarias sufridas por la sociedad europea originadas por enfermedades transmitidas por alimentos, condicionaron que todos los sistemas de seguridad y salud existentes fueran puestos en duda, con repercusiones sin precedentes en todos los sectores, demandando a las autoridades garantías en cuanto a la calidad, seguridad y veracidad del etiquetado. A consecuencia de ello, en los últimos años se ha evidenciado un interés creciente por determinar el origen y contenido de los productos destinados al consumo, con especial énfasis en las especies animales y vegetales declaradas o no en los productos elaborados, requiriendo para cumplir con los objetivos reguladores y proteccionistas, el empleo de métodos sensibles, selectivos, rápidos, automatizables, económicos y fáciles de usar. La identificación y cuantificación de especies en alimentos se aborda en la práctica mediante la detección de proteínas y/o secuencias de ADN específicas de especie, presentando esta última ciertas ventajas frente a los métodos basados en proteínas. Entre las metodologías génicas, una de las opciones más versátiles se centra en la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo final para la identificación de ADN (screening) y a tiempo real (qPCR), para determinar y cuantificar el ADN presente en muestras complejas. De las diferentes variantes metodológicas de la qPCR destacan los sistemas basados en el empleo de sondas fluorescentes específicas. Desde hace algunos años se emplea una variante de las sondas fluorescentes de hidrólisis habituales, que presenta mayor afinidad por el surco menor del ADN (MGB) para determinaciones de polimorfismos en aplicaciones biomédicas, que pueden ser de aplicación en la identificación y cuantificación de especies en alimentos, permitiendo amplificar incluso en alimentos procesados, moléculas de ADN muy fragmentado, y detectar al mismo tiempo variaciones entre especies filogenéticamente próximas y entre variedades dentro de una misma especie, mediante el análisis de polimorfismos de un único nucleótido. Así, en esta tesis se han desarrollado detectores adecuados para diferenciar mamíferos (ternera, cerdo) y aves (pavo, pollo) en muestras frescas y procesadas, utilizando como estándar de referencia para normalizar las concentraciones, los valores de CT obtenidos para una mezcla 50:50 de vaca/cerdo o pavo/pollo, reduciendo así el número de estándares requeridos. Esta aproximación permite obtener un valor realista de la diferencia en el número de copias de la secuencia diana por unidad de masa del material empleado para cada especie, pudiendo normalizar de forma sencilla, los datos obtenidos mediante qPCR a porcentajes de material de cada especie en las muestras. Estos materiales de referencia son adecuados para el análisis de alimentos procesados, ya que se pueden someter al mismo tratamiento que las muestras a ensayar. Además, se ha abordado el problema de la discriminación de especies filogenéticamente muy próximas o variedades dentro de una misma especie, abordando la diferenciación de naranja y mandarina en zumos. El método puesto a punto se basa en la utilización de un juego de cebadores comunes para las dos especies y dos sondas TaqMan® MGB que se diferencian en una sola base, correspondiente al polimorfismo que identifica cada especie. Los resultados obtenidos evidencian que el método de qPCR permite establecer un límite de detección útil para mandarina, diferenciando entre ingrediente y contaminación; si bien, se aconseja que el procedimiento de análisis vaya acompañado de suficientes reacciones control con materiales de referencia para evitar errores de cuantificación debido a la variabilidad asociada a las medidas. También se llevó a cabo la validación de un protocolo de PCR, en todas las matrices alimentarias que aparecen en el Codex Alimentarius y piensos, mostrando un LOD de 0,1% frente a material de referencia certificado, para la identificación de las secuencias P35S y TNOS. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis resaltan la importancia del empleo de materiales de referencia adaptados a la matriz a analizar, tanto en aplicaciones cualitativas como cuantitativas, a diferencia de otras propuestas que requieren la elaboración de una colección de muestras de referencia con distintas proporciones de la especie a detectar en la mezcla, obteniendo datos fiables utilizando una única muestra de referencia con contenido conocido de las especies a analizar (50% de cada una). Esta aproximación puede simplificar la puesta a punto y validación de métodos de análisis particularizados para cada tipo de matriz, facilitando la introducción y consolidación de los sistemas de identificación genética en alimentos.Ciencias de la Alimentació

DNA marker development for plant genetic analysis

Als Molekulare Marker werden kurze DNA Abschnitte herangezogen, die man für die Untersuchung und Markierung einer bestimmten Stelle im Genom eines Individuums verwendet. Immer wenn in dieser Region zwischen zwei Individuen Unterschiede auftreten, dann kann die Region als molekularer Marker verwendet werden. In den letzten zwanzig Jahren hat die Entwicklung solcher genetischen Marker die biologische Forschung in Botanik, Forst- und Landwirtschaft revolutioniert. Molekulare Marker fanden Anwendung in Populationsgenetik und Genotypisierung, in Züchtung und Taxonomie. Die Untersuchung van Individuen mittels genetischem Fingerprint ergab wertvolle einblicke in Populationsstrukturen und die bestehende genetische Vielfalt. Je nachdem, welches Genom man untersucht (Organellen, Nucleus), haben die angewandten molekularen Marker unterschiedliche Aussagekraft und es können verschiedene Fragestellungen bearbeitet werden. Während mit Organellenmarkern beispielsweise postglaziale Wanderungsrouten von Spezies rekonstruiert werden können, dienen Kern-Marker unter anderem zur Untersuchung von Verwandschaftsverhältnissen bei Einzelindividuen. Die gegenständliche Arbeit trägt mit ihren Entwicklungen zur Identifizierung neuer Marker aus den drei verschiedenen in Pflanzen vertretenen Genomen bei, wodurch verschiedene Pflanzengenetische Fragestellungen behandelt werden können. Um die genetische Vielfalt im, in den Alpen vorkommenden, Almrausch (Rhododendron ferrugineum und Rhododendron hirsutum) untersuchen zu können, wurden Microsatellitenregionen mittels aus dem Kerngenom mittels, für Dinukleotide angereicherte Genbanken isoliert. Die so neu identifizierten Kern-Marker wurden in weiterer Folge für populationsgenetische Untersuchungen in Österreichischen und Italienischen Reliktbeständen der Alpenrose verwendet. Die gleiche Anreicherungsmethode wurde angewendet, um SSR Regionen für die Unterscheidung von Paeonia suffruticosa Sorten einer Sammlung in Schönbrunn zu entwickeln. Da die Anreicherungsmethode nicht die gewünschten Ergebnisse brachte, wurde für Paeonia die Datenbankanalyse von ESTs zur Anwendung gebracht, bei der bereits publizierte Gensequenzen für die Identifikation von SSRs in exprimierten Genen herangezogen werden. Dadurch konnten weitere SSRs identifiziert werden, mit denen eine Unterscheidung der Paeonia Individuen möglich war. Mit der gleichen Methode wurden auch 24 EST-SSRs für Picea abies charakterisiert, die durch den Umstand, dass sie in exprimierten Genen liegen, auch zusätzliche Information über funktionelle Variation in den untersuchen Probensets geben können. Für Quercus robur L. und Quercus petrea L. wurden mittels standard Labormethoden sowohl SSRs als auch VNTRs isoliert welche für die Untersuchung der genetischen Vielfalt Österreichischer Eichen als auch, gemeinsam mit anderen molekularen Markern, für die Herstellung einer genetischen Karte einer Französischen Eichenkreuzung verwendet wurden. Microsatelliten sind hypervariable DNA Regionen im Genom, die leicht mutieren. Durch die Untersuchung von Pflanzenmaterial, das mittels Gewebekultur vermehrt wurde, konnte gezeigt werden, dass sich Microsatelliten sehr gut für die Detetktion von somaklonaler Variation, hervorgerufen durch Stress, eignen. Maternal vererbte Markersysteme wurden sowohl für Pappel (Populus nigra L) als auch für Fichte (Picea abies) entwickelt. Um die bestehende genetische Vielfalt in Europäischen Schwarzpappelherkünften zu untersuchen, wurde ein Chloroplastenbasiertes Markersystem entwickelt, das dazu diente, das postglaziale Wanderungsverhalten der Pappel zu untersuchen. Bei der Fichte untersucht das neu entwickelte maternale Markersystem Unterschiede in der mitochondrialen DNA der zu untersuchenden Proben. Mit dem neuen Markersystem konnte für Fichte moderate genetische Variation in 37 österreichischen Herkünften identifiziert werden. Die neu entwickelten nukleären sowie Organellen-Marker stellen wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der genetischen Vielfalt in natürlichen Populationen sowie für Zucht- und Auswahlprogramme dar. Durch die Verwendung von DNA basierten molekularen Daten kann die genetische Struktur von Populationen und auch der Genfluss zwischen Populationen gemessen werden. Die Marker dienen auch, so wie im Fall der Pappel, dazu, natürlich auftretendes klonales Material zu identifizieren. Mit den neuen Markern ist es möglich, spezifische populationsgenetische als auch phylogeographische Fragestellungen zu beantworten, und, so wie bei Rhododendron, Entscheidungen über Konservierungsmaßnahmen getroffen werden.Genetic markers use short DNA sequences in order to investigate and label a particular locus in the genome of a given individual. Whenever this particular locus shows sequence differences between two individuals, this region can be used as molecular marker. The development of a variety of DNA-based markers in the past twenty years has revolutionized biological, forestry and agricultural science. Molecular markers have demonstrated their usefulness for plant genotyping and population genetic analysis. Genome characterization by DNA-fingerprinting has generated valuable information on population structure and molecular genetic diversity. Depending on the compartmental origin of the genomic information (organelle, nucleus), molecular markers can be used for answering different questions. While organellar markers could serve for postglacial migration studies, nuclear markers can be used for studying biodiversity and paternity analysis on the level of the single individual. With the work presented here, we contributed to the marker development in different areas of plant genomics, and proved the applicability of the different marker types targeting the three different genomes (nuclear, mitochondrial, chloroplast) available in plants. In order to investigate the genetic variation present in Alpine Rhododendron populations, nuclear SSRs were developed for Rhododendron ferrugineum and Rhododendron hirsutum by generating genomic libraries enriched for dinucleotide repeats. These newly generated markers subsequently were used to investigate relict populations of the alpine rose in Italy and Austria. The same method was applied to isolate SSR regions for the identification of Paeonia suffruticosa varieties available in a germ plasm collection in Schönbrunn. In the latter case, also an in silico approach was used in order to identify SSRs present in publicly available ESTs (sequence information on Expressed Sequence Tags). By this approach, 5 additional SSR markers for Paeonia suffruticosa as well as 24 EST-SSRs for Picea abies could be generated in relatively short time. These EST-SSRs have added value as they are part of expressed sequences and thus can be used for measuring the functional diversity in Norway spruce as well as Paeonia. For Quercus robur L. and Quercus petrea L. SSRs as well as VNTRs were isolated by a standard wet lab approaches and used for diversity measurements in Austrian populations of oak. In addition, these markers, together with RAPDs, RFLPs and SCARs were mapped on a genetic map of a French controlled oak cross. Due to their hypervariable nature and sensitivity to mutations, nuclear microsatellites for oak were used to test for somaclonal variation occurring in tissue cultue material over time. With this approach we could prove the usefulness of the SSRs for testing the genome stability under stress. Maternally inherited markers were developed for Populus nigra L. and Picea abies. In order to assess the genetic diversity in Populus nigra L. sampled throughout Europe, a chloroplast DNA based marker system was developed and applied. For Norway spruce on the other hand, the maternally inherited mitochondrial genome was targeted for marker development. Using these new mt markers for Norway spruce it could be shown that there is moderate genetic variation in Austrian Norway spruce strands, not detected before. The newly developed nuclear as well as organellar markers are valuable tools for the assessment of genetic diversity in natural populations as well as plant selection programs. Using this DNA based molecular information it is possible to analyze the genetic structure of populations, to estimate gene flow between populations and, as in the case of poplar, to identify naturally occurring clonal material. With these new markers, specific population genetic as well as phylogeographical questions can be answered, and, as in the case of rhododendron, decisions on conservational measures taken