21,657 research outputs found
Identification of Hindbrain Neural Substrates for Motor Initiation in the hatchling Xenopus laevis Tadpole
Animal survival profoundly depends on the ability to detect stimuli in the environment, process them and respond accordingly. In this respect, motor responses to a sensory stimulation evolved into a variety of coordinated movements, which involve the control of brain centres over spinal locomotor circuits. The hatchling Xenopus tadpole, even in its embryonic stage, is able to detect external sensory information and to swim away if the stimulus is considered noxious. To do so, the tadpole relies on well-known ascending sensory pathway, which carries the sensory information to the brain. When the stimulus is strong enough, descending interneurons are activated, leading to the excitation of spinal CPG neurons, which causes the undulatory movement of swimming. However, the activation of descending interneurons that marks the initiation of motor response appears after a long delay from the sensory stimulation. Furthermore, the long-latency response is variable in time, as observed in the slow-summating excitation measured in descending interneurons. These two features, i.e. long-latency and variability, cannot be explained by the firing time and pattern of the ascending sensory pathway of the Xenopus tadpole. Therefore, a novel neuronal population has been proposed to lie in the hindbrain of the tadpole, and being able to 'hold' the sensory information, thus accounting for the long and variable delay of swim initiation. In this work, the role of the hindbrain in the maintenance of the long and variable response to trunk skin stimulation is investigated in the Xenopustadpole at developmental stage 37/38. A multifaceted approach has been used to unravel the neuronal mechanisms underlying the delayed motor response, including behavioural experiments, electrophysiology analysis of fictive swimming, hindbrain extracellular recordings and imaging experiments. Two novel neuronal populations have been identified in the tadpole's hindbrain, which exhibit activation patterns compatible with the role of delaying the excitation of the spinal locomotor circuit. Future work on cellular properties and synaptic connections of these newly discovered populations might shed light on the mechanism of descending control active at embryonic stage. Identifying supraspinal neuronal populations in an embryonic organism could aid in understanding mechanisms of descending motor control in more complex vertebrates
Balancing the urban stomach: public health, food selling and consumption in London, c. 1558-1640
Until recently, public health histories have been predominantly shaped by medical and scientific perspectives, to the neglect of their wider social, economic and political contexts. These medically-minded studies have tended to present broad, sweeping narratives of health policy's explicit successes or failures, often focusing on extraordinary periods of epidemic disease viewed from a national context. This approach is problematic, particularly in studies of public health practice prior to 1800. Before the rise of modern scientific medicine, public health policies were more often influenced by shared social, cultural, economic and religious values which favoured maintaining hierarchy, stability and concern for 'the common good'. These values have frequently been overlooked by modern researchers. This has yielded pessimistic assessments of contemporary sanitation, implying that local authorities did not care about or prioritise the health of populations. Overly medicalised perspectives have further restricted historians' investigation and use of source material, their interpretation of multifaceted and sometimes contested cultural practices such as fasting, and their examination of habitual - and not just extraordinary - health actions. These perspectives have encouraged a focus on reactive - rather than preventative - measures.
This thesis contributes to a growing body of research that expands our restrictive understandings of pre-modern public health. It focuses on how public health practices were regulated, monitored and expanded in later Tudor and early Stuart London, with a particular focus on consumption and food-selling. Acknowledging the fundamental public health value of maintaining urban foodways, it investigates how contemporaries sought to manage consumption, food production waste, and vending practices in the early modern City's wards and parishes. It delineates the practical and political distinctions between food and medicine, broadly investigates the activities, reputations of and correlations between London's guild and itinerant food vendors and licensed and irregular medical practitioners, traces the directions in which different kinds of public health policy filtered up or down, and explores how policies were enacted at a national and local level. Finally, it compares and contrasts habitual and extraordinary public health regulations, with a particular focus on how perceptions of and actual food shortages, paired with the omnipresent threat of disease, impacted broader aspects of civic life
Metodología de intervención para trabajar ODS. Educación a través de las artes
La Agenda 2030 presenta 17 Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS), con sus metas e indicadores universales que los países miembros de la ONU emplean para enmarcar sus políticas. Entre las metas del ODS 4 “educación de calidad” encontramos: “asegurar que todos los alumnos adquieran los conocimientos teóricos y prácticos necesarios para promover el desarrollo sostenible, entre otras cosas mediante la educación para el desarrollo sostenible y los estilos de vida sostenibles, los derechos humanos, la igualdad de género, la promoción de una cultura de paz y no violencia, la ciudadanía mundial y la valoración de la diversidad cultural y la contribución de la cultura al desarrollo sostenible”. La educación, se considera el motor de la Agenda 2030 porque, además de representar el centro del ODS 4, desempeña también un papel notable en la implementación de los demás, mejorando su alcance y efectividad.
Así pues, entre las disciplinas que sustentan este trabajo se escogió la Educación para el Desarrollo Sostenible y la Ciudadanía Global como marco de acción y punto de partida en la formación de los ciudadanos de un futuro viable, equitativo y habitable. Se continuó investigando las oportunidades del desarrollo de la Competencia Intercultural en las relaciones humanas, aquello que diferencia a unas personas de otras puede aportar al conjunto de la sociedad y cómo la educación permitiría su aprovechamiento. Con todo ello, se planteó el marco didáctico de interacción en el cual se implementó la interculturalidad en el ejercicio educativo. Se estudió así el poder de las artes como medio de motivación e inspiración a la hora de transmitir de la manera más eficaz posible los valores considerados más arriba.
El objetivo del presente estudio se centra en demostrar el potencial de las artes para fomentar las competencias comunicativas, sociales, interculturales, emocionales, de ciudadanía y sostenibilidad. Para ello, se ha realizado una investigación aplicada que deriva en una propuesta concreta de intervención con un programa educativo destinado a la enseñanza de lenguas, tanto primera como extranjera, en distintos niveles de la educación formal en Mali y en España, aplicando un método holístico basado en el paradigma interpretativo.
A través de la pintura, la literatura y el cine, se plantean una serie de actividades ideadas para crear un entorno educativo integrador, favorecer el empoderamiento del alumnado y promover el pensamiento crítico, la empatía, la resiliencia, la comunicación, la cooperación y la educación intercultural, como competencias esenciales para la consecución de los 17 ODS, la construcción de un mundo transcultural sostenible y el desarrollo de una ciudadanía global preparada para los retos del siglo XXI.
En la metodología de este proceso educativo innovador, multidisciplinar, flexible y adaptable, se ha empleado un análisis del proceso de investigación para monitorizarlo adecuadamente (DAFO). Cada una de las propuestas presenta una recogida de datos cualitativos (observación, rúbricas) y cuantitativos (encuestas, entrevistas) y se ofrece un análisis de contraste de los resultados finales.
Con todo, se espera facilitar la exigente tarea que supone hacer consciente a la sociedad de base (desde la misma infancia; desde los niveles más bajos de la misma y en todos los niveles de la educación formal) de en qué consisten los ODS y su relevancia para hacer de todas las personas corresponsables directas en su consecución para garantizar un futuro sostenible para toda la ciudadanía global.The 2030 Agenda presents 17 Sustainable Development Goals (SDGs), with their universal targets and indicators that UN member countries use to frame their policies. Among the targets of SDG 4 “quality education,” we find the one that seeks: “to ensure that all students acquire the theoretical and practical knowledge necessary to promote sustainable development, among other things through education for sustainable development and sustainable lifestyles, human rights, gender equality, the promotion of a culture of peace and non-violence, world citizenship and the appreciation of cultural diversity and the contribution of culture to sustainable development”. Education is considered the engine of the 2030 Agenda because, in addition to representing the centre of SDG 4, it also plays a notable role in the implementation of the others, improving their scope and effectiveness.
Among the disciplines that support this research, Education for Sustainable Development and Global Citizenship sets the framework for action and represents a starting point in the formation of citizens for a viable, equitable and habitable future. Global citizenship implies human relations and those and intrinsically shaped by culture. Intercultural Education and, more specifically, the development of Intercultural Competence needed to be considered. What differentiates some people from others can contribute to society as a whole and education is the means to explore and understand. For the design of a didactic framework of interaction, the power of the arts was studied as a means of motivation and inspiration when transmitting the values considered above in the most effective way possible.
The objective of this study focuses on proving the potential of the arts to promote communicative, social, intercultural, emotional, citizenship and sustainability skills. For this, the theoretical research derived in a concrete intervention proposal with an educational program in language teaching, both first and foreign languages, at different levels of formal education in Mali and Spain, applying a holistic method based on the interpretive paradigm.
Through painting, literature and cinema, a series of activities were designed to create an inclusive educational environment, favour the empowerment of students and promote critical thinking, empathy, resilience, communication, cooperation and intercultural education, as essential skills for the achievement of the 17 SDGs, the construction of a sustainable transcultural world and the development of global citizenship prepared for the challenges of the 21st century.
In the methodology of this innovative, multidisciplinary, flexible and adaptable educational process, an analysis of the research process has been used to adequately monitor it (SWOT). Each of the proposals presents a collection of qualitative data (observation, rubrics) and quantitative data (surveys, interviews) and contrast analysis of the final results is offered.
All in all, it is expected to facilitate the demanding task of making basic society aware (from childhood itself, from its lowest levels and at all levels of formal education) of what the SDGs consist of and their relevance to make all people directly co-responsible in its achievement to guarantee a sustainable future for all global citizens
The applied psychology of addictive orientations : studies in a 12-step treatment context.
The clinical data for the studies was collected at The PROMIS Recovery Centre, a Minnesota Model treatmentc entre for addictions,w hich encouragesth e membership and use of the 12 step Anonymous Fellowships, and is abstinence based. The area of addiction is contextualised in a review chapter which focuses on research relating to the phenomenon of cross addiction. A study examining the concept of "addictive orientations" in male and female addicts is described, which develops a study conductedb y StephensonM, aggi, Lefever, & Morojele (1995). This presents study found a four factor solution which appeared to be subdivisions of the previously found Hedonism and Nurturance factors. Self orientated nurturance (both food dimensions, shopping and caffeine), Other orientated nurturance (both compulsive helping dimensions and work), Sensation seeking hedonism (Drugs, prescription drugs, nicotine and marginally alcohol), and Power related hedonism (Both relationship dimensions, sex and gambling. This concept of "addictive orientations" is further explored in a non-clinical population, where again a four factor solution was found, very similar to that in the clinical population. This was thought to indicate that in terms of addictive orientation a pattern already exists in this non-clinical population and that consideration should be given to why this is the case. These orientations are examined in terms of gender differences. It is suggested that the differences between genders reflect power-related role relationships between the sexes. In order to further elaborate the significance and meaning behind these orientations, the next two chapters look at the contribution of personality variables and how addictive orientations relate to psychiatric symptomatology. Personality variables were differentially, and to a considerable extent predictably involved with the four factors for both males and females.Conscientiousness as positively associated with "Other orientated Nurturance" and negatively associated with "Sensation seeking hedonism" (particularly for men). Neuroticism had a particularly strong association with the "Self orientated Nurturance" factor in the female population. More than twice the symptomatology variance was explained by the factor scores for females than it was for males. The most important factorial predictors for psychiatric symptomatology were the "Power related hedonism" factor for males, and "Self oriented nurturance" for females. The results are discussed from theoretical and treatment perspectives
The company she keeps : The social and interpersonal construction of girls same sex friendships
This thesis begins a critical analysis of girls' 'private' interpersonal and social relations as they are enacted within two school settings. It is the study of these marginal subordinated worlds productivity of forms of femininity which provides the main narrative of this project. I seek to understand these processes of (best) friendship construction through a feminist multi-disciplinary frame, drawing upon cultural studies, psychoanalysis and accounts of gender politics. I argue that the investments girls bring to their homosocial alliances and boundary drawing narry a psychological compulsion which is complexly connected to their own experiences within the mother/daughter bond as well as reflecting positively an immense social debt to the permissions girls have to be nurturant and ; negatively their own reproduction of oppressive exclusionary practices. Best friendship in particular gives girls therefore, the experience of 'monogamy' continuous of maternal/daughter identification, reminiscent of their positioning inside monopolistic forms of heterosexuality. But these subcultures also represent a subversive discontinuity to the public dominance of boys/teachers/adults in schools and to the ideologies and practices of heterosociality and heterosexuality. By taking seriously their transmission of the values of friendship in their chosen form of notes and diaries for example, I was able to access the means whereby they were able to resist their surveillance and control by those in power over them. I conclude by arguing that it is through a recognition of the valency of these indivisiblly positive and negative aspects to girls cultures that Equal Opportunities practitioners must begin if they are serious about their ambitions. Methods have to be made which enable girls to transfer their 'private' solidarities into the 'public' realm, which unquestionably demands contesting with them the causes and consequences of their implication in the divisions which also contaminate their lives and weaken them
Strung pieces: on the aesthetics of television fiction series
As layered and long works, television fiction series have aesthetic properties that are built over time, bit by bit. This thesis develops a group of concepts that enable the study of these properties, It argues that a series is made of strung pieces, a system of related elements. The text begins by considering this sequential form within the fields of film and television. This opening chapter defines the object and methodology of research, arguing for a non-essentialist distinction between cinema and television and against the adequacy of textual and contextual analyses as approaches to the aesthetics of these shows. It proposes instead that these programmes should be described as televisual works that can be scrutinised through aesthetic analysis. The next chapters propose a sequence of interrelated concepts. The second chapter contends that series are composed of building blocks that can be either units into which series are divided or motifs that unify series and are dispersed across their pans. These blocks are patterned according to four kinds of relations or principles of composition. Repetition and variation are treated in tandem in the third chapter because of their close connection, given that variation emerges from established repetition. Exception and progression are also discussed together in the fourth chapter since they both require a long view of these serial works. The former, in order to be recognised as a deviation from the patterns of repetition and variation. The latter, In order to be understood in Its many dimensions as the series advances. Each of these concepts is further detailed with additional distinctions between types of units, motifs, repetitions, variations, and exceptions, using illustrative examples from numerous shows. In contrast, the section on progression uses a single series as case study, Carnivàle (2003-05), because this is the overarching principle that encompasses all the others. The conclusion considers the findings of the research and suggests avenues for their application
Reforming the United Nations
The thesis deals with the financial crisis that the United Nations faced starting in 1985 when the US Congress decided to withhold a significant part of the US contribution to the UN regular budget in order to force a greater say for the major contributors on budgetary issues, budgetary restraint and greater efficiency. The UN responded by the adoption of resolution 41/213 of 19 December 1986 that was based on the recommendations of a Group of High-level Intergovernmental Experts ("G-18") set up a year earlier. A new system was introduced regarding the formulation of the regular budget of the United Nations Organisation and a broader process of reform was initiated including a restructuring of the Secretariat and of the intergovernmental machinery in the economic and social fields. After an introductory chapter (Chapter I), the thesis examines the UN problems at the budgetary/financial and administrative/structural levels, the solutions proposed from within and without the United Nations established framework and the actual attempts at reform (Chapters II and ifi). The realisation that the implementation of reforms is rather disjointed and often unsuccessful (e.g. the failure to restructure the intergovernmental machi.neiy) prompts a search for the deeper causes of the UN problems at the political level and the attitudes of the main actors, namely the USA, the USSR, some up-and-coming states, notably Japan, the Third World states and, finally, of the UN Secretary-General and the Secretariat (Chapter 1V). Although the financial crisis may have subsided since 1988 and the USA seem committed to paying up their dues, the deeper UN crisis of identity has not been resolved and is expected to resurface if no bold steps are taken. In that direction, some possible alternative courses for the UN in the future are discussed drawing upon theory and practice (Chapte
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NOAH-H, a deep-learning, terrain classification system for Mars: Results for the ExoMars Rover candidate landing sites
In this investigation a deep learning terrain classification system, the “Novelty or Anomaly Hunter – HiRISE” (NOAH-H), was used to classify High Resolution Imaging Science Experiment (HiRISE) images of Oxia Planum and Mawrth Vallis. A set of ontological classes was developed that covered the variety of surface textures and aeolian bedforms present at both sites. Labelled type-examples of these classes were used to train a Deep Neural Network (DNN) to perform semantic segmentation in order to identify these classes in further HiRISE images.
This contribution discusses the methods and results of the study from a geomorphologists perspective, providing a case study applying machine learning to a landscape classification task. Our aim is to highlight considerations about how to compile training datasets, select ontological classes, and understand what such systems can and cannot do. We highlight issues that arise when adapting a traditional planetary mapping workflow to the production of training data. We discuss both the pixel scale accuracy of the model, and how qualitative factors can influence the reliability and usability of the output.
We conclude that “landscape level” reliability is critical for the use of the output raster by humans. The output can often be more useful than pixel scale accuracy statistics would suggest, however the product must be treated with caution, and not considered a final arbiter of geological origin. A good understanding of how and why the model classifies different landscape features is vital to interpreting it reliably. When used appropriately the classified raster provides a good indication of the prevalence and distribution of different terrain types, and informs our understanding of the study areas. We thus conclude that it is fit for purpose, and suitable for use in further work
The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros.
Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas.
El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia.
Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt.
En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina.
Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio.
Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones.
En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga.
Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión.
Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2.
Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador.
Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década.
En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens.
Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA).
A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de
Patterns of subspecies diversity in the giraffe, Giraffa camelopardalis (L. 1758): comparison of systematic methods and their implications for conservation policy
This thesis examines the subspecific taxonomic status of the giraffe and considers the role of formal taxonomy in the formulation of conservation policy. Where species show consistent. geographically structured phenotypic variation such geographic patterns may indicate selective forces (or other population-level effects) acting. upon local populations. These consistent geographic patterns may be recognised formally as subspecies and may be of interest in single or multi-species biodiversity or biogeography studies for delimiting areas of conservation priority. Subspecies may also be used in the formulation of management policies and legislation. Subspecies are, by definition, allopatric. This thesis explicitly uses methodology of systematic biology and phylogenetic reconstruction to investigate patterns of variation between geographic groups. The taxonomic status of the giraffe is apposite for review. The species provides three independent data sets that may be analysed quantitatively for geographic structure; pelage patterns, morphology and genetics. Museum specimens. grouped according to geographic origin, were favoured for study as more than one type of data was often available for an individual. Population aggregation analysis of forty pelage pattern characters maintained six separate subspecies, while agglomerating some neighbouring populations into a subspecies. A 'traditional' morphometric approach, using multivariate statistical analysis of adult skull measurements, was complemented by a geometric morphometric approach; landmarkrestricted eigenshape analysis. Four morphologically distinct groups were recognised by both morphological analyses. Phylogenetic analysis of mitochondrial DNA control region sequences indicates five major cIades. Nested cIade analysis identifies population fragmentation, range expansion and genetic isolation by distance as contributing to the genetic structure of the giraffe. The results of the analyses show remarkable congruence. These results are discussed in terms of the formulation of conservation policy and the differing requirements of'blological and legal classification systems. The value of a formal taxonomic framework to the recognition, and subsequent conservation, of biodiversity is emphasised
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