How can natural products serve as a viable source of lead compounds for the development of new/novel anti-malarials?

Malaria continues to be an enormous global health challenge, with millions of new infections and deaths reported annually. This is partly due to the development of resistance by the malaria parasite to the majority of established anti-malarial drugs, a situation that continues to hamper attempts at controlling the disease. This has spurred intensive drug discovery endeavours geared towards identifying novel, highly active anti-malarial drugs, and the identification of quality leads from natural sources would greatly augment these efforts. The current reality is that other than compounds that have their foundation in historic natural products, there are no other compounds in drug discovery as part of lead optimization projects and preclinical development or further that have originated from a natural product start-point in recent years. This paper briefly presents both classical as well as some more modern, but underutilized, approaches that have been applied outside the field of malaria, and which could be considered in enhancing the potential of natural products to provide or inspire the development of anti-malarial lead compounds

Marine bioactive peptides - an overview of generation, structure and application with a focus on food sources

The biggest obstacles in the application of marine peptides are two-fold, as in the case of non-marine plant and animal-derived bioactive peptides: elucidating correlation between the peptide structure and its effect and demonstrating its stability in vivo. The structures of marine bioactive peptides are highly variable and complex and dependent on the sources from which they are isolated. They can be cyclical, in the form of depsipeptides, and often contain secondary structures. Because of steric factors, marine-derived peptides can be resistant to proteolysis by gastrointestinal proteases, which presents an advantage over other peptide sources. Because of heterogeneity, amino acid sequences as well as preferred mechanisms of peptides showing specific bioactivities differ compared to their animal-derived counterparts. This review offers insights on the extreme diversity of bioactivities, effects, and structural features, analyzing 253 peptides, mainly from marine food sources. Similar to peptides in food of non-marine animal origin, a significant percentage (52.7%) of the examined sequences contain one or more proline residues, implying that proline might play a significant role in the stability of bioactive peptides. Additional problems with analyzing marine-derived bioactive peptides include their accessibility, extraction, and purification; this review considers the challenges and proposes possible solutions

Natural products in modern life science

With a realistic threat against biodiversity in rain forests and in the sea, a sustainable use of natural products is becoming more and more important. Basic research directed against different organisms in Nature could reveal unexpected insights into fundamental biological mechanisms but also new pharmaceutical or biotechnological possibilities of more immediate use. Many different strategies have been used prospecting the biodiversity of Earth in the search for novel structure–activity relationships, which has resulted in important discoveries in drug development. However, we believe that the development of multidisciplinary incentives will be necessary for a future successful exploration of Nature. With this aim, one way would be a modernization and renewal of a venerable proven interdisciplinary science, Pharmacognosy, which represents an integrated way of studying biological systems. This has been demonstrated based on an explanatory model where the different parts of the model are explained by our ongoing research. Anti-inflammatory natural products have been discovered based on ethnopharmacological observations, marine sponges in cold water have resulted in substances with ecological impact, combinatory strategy of ecology and chemistry has revealed new insights into the biodiversity of fungi, in depth studies of cyclic peptides (cyclotides) has created new possibilities for engineering of bioactive peptides, development of new strategies using phylogeny and chemography has resulted in new possibilities for navigating chemical and biological space, and using bioinformatic tools for understanding of lateral gene transfer could provide potential drug targets. A multidisciplinary subject like Pharmacognosy, one of several scientific disciplines bridging biology and chemistry with medicine, has a strategic position for studies of complex scientific questions based on observations in Nature. Furthermore, natural product research based on intriguing scientific questions in Nature can be of value to increase the attraction for young students in modern life science

Exploring the Ligand-Protein Networks in Traditional Chinese Medicine: Current Databases, Methods, and Applications

The traditional Chinese medicine (TCM), which has thousands of years of clinical application among China and other Asian countries, is the pioneer of the "multicomponent-multitarget" and network pharmacology. Although there is no doubt of the efficacy, it is difficult to elucidate convincing underlying mechanism of TCM due to its complex composition and unclear pharmacology. The use of ligand-protein networks has been gaining significant value in the history of drug discovery while its application in TCM is still in its early stage. This paper firstly surveys TCM databases for virtual screening that have been greatly expanded in size and data diversity in recent years. On that basis, different screening methods and strategies for identifying active ingredients and targets of TCM are outlined based on the amount of network information available, both on sides of ligand bioactivity and the protein structures. Furthermore, applications of successful in silico target identification attempts are discussed in detail along with experiments in exploring the ligand-protein networks of TCM. Finally, it will be concluded that the prospective application of ligand-protein networks can be used not only to predict protein targets of a small molecule, but also to explore the mode of action of TCM

Marine Bioactive Peptides II: Structure, Function, and Therapeutic Potential

This second edition of the Special Issue “Marine Bioactive Peptides: Structure, Function, and Therapeutic Potential - II” published papers on up-to-date information regarding isolation, structural elucidation, functional characterization, and therapeutic potential evaluation of peptides isolated from marine organisms. Chemical synthesis and biotechnological production of marine peptides and their mimetics will also be a focus of this Special Issue. In addition, this Special Issue will publish new results arising from a peptidomic approach. 24 Papers were accepted and included in the first issue, which we published as a Special Issue book (https://www.mdpi.com/books/pdfview/book/1742). Following the success of the first Special Issue, as Guest Editor, I invite researchers in the field to contribute to the second edition entitled " Marine Bioactive Peptides: Structure, Function, and Therapeutic Potential - II] "

Development and application of an enzyme immunoassay for the detection of the mycotoxin Fumigaclavine A

The present study describes the development of specific polyclonal antibodies against fumigaclavine A (FuA) in rabbits, and the development of a highly sensitive enzyme immunoassay (EIA) for this mycotoxin. The Mannich condensation reaction with formaldehyde was used to conjugate FuA to keyhole limpet hemocyanin (KLH) as the immunogen, and to bovine serum albumine (BSA) for as the coating antigen. Conjugation of FuA to KLH with formaldehyde proved to be an effective approach for the preparation of immunogen for anti-FuA antibody production. A competitive indirect EIA was optimized using antiserum obtained from one rabbit. The EIA was very sensitive for FuA, with a 50% inhibition concentration (IC50) value of 3.3 ng/ml and a detection limit of the standard curve in buffer solutions of 0.5 ng/ml. The EIA was very specific for FuA with 1.3%, 12.6%, and 0.2% cross-reactivity with FuB, FuC, and FuD, respectively. IsoFuA and several other lysergic acid derivatives (ergonovine, ergotamine, and alpha-ergocryptine) were tested but did not cross-react in this assay. The EIA was applied to the analysis of FuA in silage and in tissue from the respiratory system of birds with aspergillosis. The detection limit for FuA in silage was at 10 ng/g, average recoveries from artificially contaminated control samples were 77.8%. None of 24 analyzed silage samples contained detectable amounts of FuA. Although the number of samples was limited, the results indicate that there is not a widespread problem of FuA in silage. The detection limit of the assay for FuA in tissue from the respiratory system of birds was at 1.5 ng/g, with average recoveries from artificially contaminated of 92.7%. FuA was found in 66% tissue samples of aspergillosis cases. Cultivation of fungal growth on respiratory tissue samples of aspergillosis cases on malt extract agar (MEA) yielded fungal material which was typical for A. fumigatus. When the mycelium was extracted and assayed by FuA EIA, high amounts of FuA was found (up to 8 mg/g mycelium). Further analysis of the mycelium extract by HPLC found FuA, FuC, and other unidentified compounds. Hydrolysis of FuC which have been isolated from mycelium extract of A. fumigatus gave a new fumigaclavine derivative. FuD is proposed as the name of this compound. Different specificity pattern of the FuA EIA and that of a previously developed ergonovine EIA were studied. In competitive indirect EIA, the anti-FuA antibody did detect neither ergonovine nor IsoFuA. Conversely, by competitive direct EIA format, the anti-ergonovine antibody was able to detect both FuA and IsoFuA. Using these assays in combination with HPLC separation of cheese extracts, a series of blue-veined cheeses from the German market were analyzed. None of 16 blue-veined cheese samples contained FuA. However, the presence of IsoFuA in blue-veined cheese samples was detected using the ergonovine EIA. This is the first description of antibodies against FuA and the first development of an EIA for FuA. This is also the first report demonstrating that FuA is correlated with aspergillosis in birds. However, the role of this mycotoxin in this disease remains to be clarified.Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung spezifischer Antikörper gegen Fumigaclavin A (FuA) und die Entwicklung eines hochempfindlichen Enzymimmuntests (EIA) für dieses Mykotoxin. Die Mannich-Kondensation mit Formaldehyd wurde verwendet, um Fumigaclavin A an keyhole limpet hemocaynin (KLH) als Immunogen und an bovines Serumalbumin (BSA) als Beschichtungsantigen zukoppeln. Die Kopplung von FuA an KLH mittels Formaldehyd erwies sich als effektiver Ansatz zur Herstellung eines Immunogens zur Gewinnung von Anti-FuA Antikörpern in Kaninchen. Ein kompetitiver indirekter EIA wurde erstellt und optimiert, unter Verwendung polykloner Antikörper eines Kaninchens. Der EIA war sehr empfindlich für FuA, mit einer 50%-Dosis von 3,3 ng/ml und einer Nachweisgrenze von 0,5 ng/ml (in Pufferlösung). Der EIA war relativ spezifisch für FuA, mit Kreuzreaktionen von 1,3%, 12,6% bzw. 0,2% Kreuzreaktion für FuB, FuC bzw. FuD. IsoFuA und einige andere getestete Lysergsäurederivate (Ergonovin, Ergotamin, und alpha- Ergokryptin) wurden ebefalls untersucht, zeigten aber keine Kreuzreaktion in diesem Testsystem. Der EIA wurde zur Untersuchung von FuA in Silage und in Gewebsproben (Repirationstrakt) von Vögeln mit Aspergillose eingesetzt. Die Nachweisgrenze für FuA in Silage betrug 10 ng/g, die durchschnittlichen Wiederfindungsraten für FuA in künstlich kontaminierten Kontrollproben lagen bei 77,8%. Keine der 24 untersuchten Proben enthielt nachweisbare Gehalte an FuA. Obwohl nur eine begrenzte Probenanzahl untersucht wurde, zeigen die Ergebnisse, dass FuA kein weit verbreitetes Problem in Silage darstellt. Die Nachweisgrenze für FuA in Gewebsproben des Repirationstrakts von Vögeln lag bei 1,5 ng/g, mit durchschnittlichen Wiederfindungsraten für FuA in künstlich kontaminierten Proben von 92,7%. FuA wurde in 66% der Proben von Vögeln mit Aspergillose nachgewiesen. Bei einer Kultivierung von Pilzisolaten des Atmungstraktes auf Malzextraktagar (MEA) entwickelte sich ein Mycel, das typisch für A. fumigatus war. Bei Extraktion des Mycels und Untersuchung im FuA-EIA wurden große Mengen an FuA (bis zu 8 mg/g Mycel) nachgewiesen. Bei einer weiteren Untersuchung des Mycelextrakts mittels HPLC wurden FuA, FuC und andere, nicht identifizierte Komponenten gefunden. Eine Hydrolyse von FuC, das aus dem Mycelextrakt von A. fumigatus gewonnen wurde, ergab ein neues Fumigaclavin-Derivat. FuD wird als Name für diese Verbindung vorgeschlagen. Zur Untersuchung von Blauschimmelkäse auf Clavin-Alkaloide wurden die unterschiedliche Spezifitäten des FuA-EIA und eines zuvor entwickelten Ergonovin-EIA ausgenutzt. Im kompetitiven indirekten EIA für FuA waren alle Proben negativ. Dagegen wurde bei Verwendung eines kompetitiven direkten EIA unter Verwendung von Anti-Ergonovin-Antikörpern hohe Meßwerte erzielt. Bei einer Untersuchung mit Hilfe dieser beiden Testsysteme und einer HPLCTrennung von Käse-Extrakten wurden Blauschimmelkäse des deutschen Marktes untersucht. Keine der 16 untersuchten Proben enthielt FuA, jedoch wurde die Anwesenheit von IsoFuA in Blauschimmelkäse nachgewiesen. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals die die Entwicklung von Antikörpern gegen FuA und eines Enzymimmuntests für dieses Mykotoxin. Auch wird erstmalig eine Korrelation zwischen FuA-Gehalten in Gewebe des Repirationstrakts und der Aspergillose von Vögeln beschrieben. Die Rolle dieses Mykotoxins bei diesem Krankheitsbild bleibt allerdings noch zu klären

Marine Drug Research in China: Selected Papers from the 15-NASMD Conference

The Book covers this whole field, from the discovery of structurally new and bioactive natural products (including biomacromolecules), from marine macro-/micro-organisms, to the pharmacodynamics, pharmacokinetics, metabolisms, and mechanisms of marine-derived lead compounds, both in vitro and in vivo, along with the synthesis and/or structural optimization of marine-derived lead compounds and their structure–activity relationships. Taken together, this Special Issue reprint not only provides inspiration for the discovery of marine-derived novel bioactive compounds, but also sheds light on the further research and development of marine candidate drugs

An integrated metabolomics approach using LC–HRMS, NMR and chemometrics for the profiling of the red alga Laurencia: Dereplication, tracing of bioactive compounds and detection of new natural products

Το θαλάσσιο περιβάλλον, καλύπτοντας περίπου το 70% της επιφάνειας της Γης, φιλοξενεί μια σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη βιοποικιλομορφία, προσφέροντας έτσι μια τεράστια προοπτική για την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων, με στόχο τη θεραπεία ανίατων ασθενειών ή την αντιμετώπιση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Προκειμένου να επιβιώσουν σε ένα διαρκώς ανταγωνιστικό οικοσύστημα, οι θαλάσσιοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει μοναδικούς αμυντικούς μηχανισμούς, συνθέτοντας βιοδραστικές ενώσεις, οι οποίες σε ορισμένες περιπτώσεις παρουσιάζουν ασύγκριτη πολυπλοκότητα σε σχέση με τις ενώσεις που συντίθενται από τους χερσαίους οργανισμούς. Τα ροδοφύκη του γένους Laurencia θεωρούνται από τις πιο πλούσιες πηγές θαλάσσιας προέλευσης νέων δευτερογενών μεταβολιτών. Το γένος Laurencia περιλαμβάνει έως σήμερα 146 ταξινομικά αποδεκτά είδη, τα οποία συναντώνται κυρίως σε τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες παράκτιες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης και της Μεσογείου Θάλασσας. Παρόλο που έχει μελετηθεί εκτεταμένα τα τελευταία 50 χρόνια - οι σχετικές καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων MarinLit υπερβαίνουν τις 1.200 - νέοι μεταβολίτες εξακολουθούν να απομονώνονται από τα είδη του γένους. Τα είδη του γένους Laurencia βιοσυνθέτουν ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών μεταβολιτών, περιλαμβάνοντας σεσκιτερπένια, διτερπένια, τριτερπένια και C15 ακετογενίνες, οι οποίοι συχνά χαρακτηρίζονται από την παρουσία αλογόνων. Ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων μεταβολιτών εμφανίζει σημαντική βιολογική δράση, όπως αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, εντομοκτόνο και κυτταροτοξική, όπως παρουσιάζεται από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας στο Κεφάλαιο 1. Πρόσφατες αναφορές εστιάζουν στην πολυπλοκότητα της ταξινόμησης των ροδοφυκών του γένους Laurencia, η οποία σχετίζεται με την εκτεταμένη μορφολογική πλαστικότητα, σε συνδυασμό με τη χημική διακύμανση, αντανακλώντας σε σημαντικό βαθμό την επίδραση περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Η μεταβολομική αποτελεί μια αναδυόμενη τεχνολογία με εφαρμογές που εκτείνονται σε διάφορους τομείς, όπως η υγεία, τα φυσικά προϊόντα, οι βιοτεχνολογικές εφαρμογές και η διατροφή, ενώ ο αριθμός των μεταβολομικών μελετών σε θαλάσσιους οργανισμούς είναι περιορισμένος. Για μια μεταβολομική μελέτη απαιτείται η εφαρμογή αναλυτικών τεχνικών υψηλής απόδοσης, όπως η φασματοσκοπία NMR και η φασματομετρία μάζας (MS), σε συνδυασμό με εξειδικευμένα λογισμικά και βάσεις vi δεδομένων. Όσον αφορά στους θαλάσσιους οργανισμούς, ο μεγάλος αριθμός ενώσεων με άγνωστες δομές, καθώς και ο περιορισμένος αριθμός δεδομένων που μπορεί να ανακτηθεί από βάσεις δεδομένων, εξειδικευμένων στα φυσικά προϊόντα θαλάσσιας προέλευσης, αντανακλούν την αυξημένη δυσκολία στην αποτίμηση του πολύπλοκου μεταβολικού αποτυπώματος τους. Εφαρμογές της μεταβολομικής στους θαλάσσιους οργανισμούς και οι ερευνητικές προκλήσεις που σχετίζονται με αυτές εξετάζονται στο Κεφάλαιο 2. Η παρούσα μελέτη στόχευσε στο συνολικό δευτερογενές μεταβολικό αποτύπωμα εκχυλισμάτων της Laurencia εφαρμόζοντας σύγχρονες ολιστικές τεχνικές, όπως φασματοσκοπία UHPLC-PDA-HRMS και ΗR NMR, και εξειδικευμένα λογισμικά επεξεργασίας των πειραματικών δεδομένων, βάσεις δεδομένων εμπορικά διαθέσιμες (MarinLit), καθώς και in-house βιβλιοθήκες δεδομένων που αναπτύχθηκαν και εργαλεία πολυμεταβλητής ανάλυσης. Η μεθοδολογία, η οποία αναπτύχθηκε και περιγράφεται στο Κεφάλαιο 4, εφαρμόστηκε για τη σάρωση εκχυλισμάτων του γένους Laurencia ώστε να αναγνωριστούν ήδη γνωστοί βιβλιογραφικά μεταβολίτες (dereplication) και παράλληλα να εντοπιστεί η παρουσία νέων μεταβολιτών από τα πρώτα στάδια της χημικής ανάλυσης, ιεραρχώντας με αυτό τον τρόπο ποια δείγματα θα υποβάλλονταν περαιτέρω στη μακρά και επίπονη διαδικασία της φυτοχημικής ανάλυσης. Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση οδήγησε: α) Στην υλοποίηση μιας ‘in-house’ βάσης δεδομένων NMR που εστιάζει στα ροδοφύκη του γένους Laurencia και περιλαμβάνει πειραματικά ή/και βιβλιογραφικά δεδομένα NMR για δευτερογενείς μεταβολίτες προερχόμενους από είδη Laurencia και Aplysia, γνωστού και ως «λαγού της θάλασσας» που παρουσιάζει στενή οικολογική σχέση με τη Laurencia καθώς αυτή αποτελεί μέρος της διατροφής του. Η βάση δεδομένων υλοποιήθηκε στο περιβάλλον του λογισμικού ACD/Labs και διευκολύνει την αποτίμηση των δεδομένων 2D HSQC NMR με τη χρήση αλγορίθμων προσομοίωσης, οδηγώντας στην ασφαλή ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών που υπάρχουν στο δείγμα. Η βάση δεδομένων περιλαμβάνει περίπου 300 εγγραφές που αντιστοιχούν σε δομικά διαφορετικές ενώσεις από τις κατηγορίες των C15 ακετογενινών, σεσκιτερπενίων και διτερπενίων. β) Στην ανάπτυξη μιας βιβλιοθήκης LC-MS που περιλαμβάνει μεταβολίτες της Laurencia που έχουν απομονωθεί στο παρελθόν στο εργαστήριό μας vii γ) Στον ταχύτατο εντοπισμό δύο νέων C15 ακετογενινών της ομάδας των βρωμοαλλενίων (μαριλζαλλένιο B και χονδριοαλλένιο) σε ένα εκχύλισμα του είδους Laurencia chondrioides που συλλέχθηκε στην Κεφαλονιά. Τα αποτελέσματα της μελέτης έχουν ήδη δημοσιευθεί (Kokkotou et al., Phytochemistry, 2014, 108, 208-219). Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 5, εκπονήθηκε μια μελέτη που περιλάμβανε 103 δείγματα από είδη Laurencia από τις Ελληνικές ακτές, η οποία διερεύνησε τη δυνατότητα της ανάλυσης του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος με την εφαρμογή LCMS/PCA και 1H NMR/PCA με στόχο τη διάκριση μοτίβων μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών του φύκους. Τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης συνοψίζονται στα ακόλουθα: α) Δείγματα Laurencia, τα οποία αναδείχθηκαν ως έκτροπα (outliers) υπέδειξαν την παρουσία νέων φυσικών προϊόντων β) Aναδείχθηκαν δύο κύριοι μεταβολικοί τύποι (metabotypes) στα δείγματα Laurencia που μελετήθηκαν, ο μεταβολικός τύπος Α που περιλαμβάνει ένα φάσμα C15 ακετογενινών και ο μεταβολικός τύπος Β, που χαρακτηρίζεται κυρίως από την παρουσία σεσκιτερπενίων. γ) Επιπλέον, η μελέτη αποκάλυψε την επίδραση τη θαλάσσιας οικολογικής περιοχής (Ιόνιο και Αιγαίο Πέλαγος) σε σχέση με την έκφραση των δύο μεταβολικών τύπων στα δείγματα του είδους Laurencia obtusa. Αυτή είναι η πρώτη μεταβολομική μελέτη του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος, η οποία πραγματοποιείται σε μεγάλο αριθμό πληθυσμών του γένους Laurencia. Στο Κεφάλαιο 6 εφαρμόστηκε στοχευμένη LC-HRMS σάρωση σε συλλογή πληθυσμών του γένους Laurencia για τον εντοπισμό βιοδραστικών διτερπενίων και συγκεκριμένα του διτερπενίου νεοροτζιολτριόλη (NRG) με ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση, το οποίο είχε απομονωθεί αρχικά από έναν πληθυσμό Laurencia glandulifera από την Κεφαλονιά, ενός δομικού αναλόγου της, της νεοροτζιολδιόλης, καθώς και των συγγενών δομών νεοροτζιολδιόλη Β και πρεβεζόλες Α-Ε, που είχαν απομονωθεί από ένα δείγμα L. obtusa από τις ακτές της Πρέβεζας. Αυτές οι ενώσεις πιθανόν να ανήκουν στo ίδιo βιοσυνθετικό μονοπάτι και έτσι αυτή η μελέτη σάρωσης με LC-HRMS στόχευσε στην ανίχνευση αυτών των διτερπενίων ή ακόμη και συναφών αναλόγων. Η παρουσία των ενώσεων-στόχων εντοπίστηκε σε πληθυσμό Laurencia sp. που συλλέχθηκε από τον κόλπο της Βάτσας στη Κεφαλονιά. Στη συνέχεια, η συλλογή από την ίδια περιοχή μεμονωμένων στελεχών του συγκεκριμένου πληθυσμού επέτρεψε τη viii διεξαγωγή μιας ενδο-πληθυσμιακής μελέτης. Η ανάλυση LC-HRMS/PCA κατέδειξε σαφώς την ενδο-πληθυσμιακή διακύμανση στο περιεχόμενο, αλλά ακόμα και την παρουσία/απουσία των ενώσεων-στόχων και περαιτέρω ξεχώρισε δύο ομάδες δειγμάτων συγκριτικά με τον μέσο πληθυσμό, μία ομάδα που χαρακτηρίζεται από ένα φάσμα διτερπενίων και μία άλλη ομάδα που περιλαμβάνει κυρίως σεσκιτερπένια. Στο χάρτη της PCA, η κατανομή των δειγμάτων σε σχήμα αντεστραμμένου "V", καθώς και η διευθέτηση των προαναφερθέντων ομάδων δειγμάτων υποδηλώνουν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της αφθονίας των διτερπενίων και των σεσκιτερπενίων, αναδεικνύοντας έτσι μία «αλληλεπίδραση» (cross-talk) μεταξύ των δύο οδών που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση των τερπενίων, δηλαδή το μονοπάτι της μεθυλερυθριτόλης (MEP) και το μονοπάτι του μεβαλονικού οξέος (MVA). Αυτή η διασύνδεση ίσως αποτελεί μια ερμηνεία για την προτιμώμενη βιοσύνθεση των βιοδραστικών διτερπενίων εις βάρος των σεσκιτερπενίων. Η μελέτη ανέδειξε επίσης την εποχιακή διακύμανση του δευτερογενούς μεταβολικού προφίλ του συγκεκριμένου πληθυσμού του ροδοφύκους, η οποία πιθανώς να εξαρτάται από τη μεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών ή από την έκθεση σε παθογόνους παράγοντες, επιφυτικούς ή φυτοφάγους οργανισμούς με συνέπεια την παραγωγή βιοδραστικών διτερπενίων ή σεσκιτερπενίων.Natural products, originating from terrestrial or marine organisms, constitute a prolific source for pharmaceutically relevant products providing unique structural chemodiversity. The marine environment, covering approximately 70% of the Earth’s surface hosts a largely unexplored biodiversity, offering a huge potential for the discovery of novel compounds to target incurable diseases or overcome drug resistance. Due to the wide range of competitive ecosystems they survive in, marine organisms have developed unique defense strategies and bioactive compounds that, in some cases, are unparalleled by their terrestrial counterparts. Red algae of the genus Laurencia are considered as one of the richest sources of new secondary metabolites. The genus Laurencia currently encompasses 146 taxonomically accepted species which are mainly found in tropical, subtropical, and temperate coastal waters, including the Mediterranean Sea. Although intensively investigated for the last 50 years, new metabolites are still being isolated from Laurencia species. Displaying more than 1,200 records in MarinLit database, Laurencia species biosynthesize a wide spectrum of secondary metabolites, including sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes and C15 acetogenins that are frequently characterized by the presence of halogen atoms. An array of the isolated metabolites exhibit important activities, such as antibacterial, antifungal, insecticidal and cytotoxic, as reviewed in Chapter 1. Recent reports comment on the complexity of the taxonomy of red algae of the genus Laurencia which is related to the extended morphological plasticity along with the chemical variation influenced to a significant degree by environmental and genetic factors. Past attempts towards species identification based on characteristic metabolites have proven unsuccessful and more importantly efforts to re-isolate bioactive compounds were severely impeded. Metabolomics consists an emerging technology with applications expanding in different areas, such as health, natural products, biotechnological applications and nutrition. Metabolomics platforms have been only applied to a limited number of projects relating to marine organisms. Metabolomics studies require the application of high-throughput analytical techniques, such as NMR spectroscopy and mass spectrometry (MS), in combination with software (s/w) tools and databases. The high number of compounds with unknown structures and the limited information retrieved from databases generated for marine organisms reflect the increased difficulty in assessing the complex ii metabolome of the marine ecosystem. Applications of metabolomics in marine organisms and research challenges are reviewed in Chapter 2. The current study addressed the global secondary metabolic profile of Laurencia crude extracts by applying state-of-the-art holistic techniques, i.e. UHPLC–PDA–HRMS and HR NMR spectroscopy, along with software tools, databases (MarinLit and those developed in-house) and multivariate data analysis tools. The developed pipeline described in Chapter 4 was applied as a screening strategy for dereplication purposes and for pinpointing the presence of new metabolites already from the very early stages of a chemical investigation and prioritize selected Laurencia crude extracts to be further subjected to the long and laborious procedure of in-depth phytochemical analysis. This integrated approach has led to: a) The construction of an ‘in-house’ Laurencia-focused NMR database, incorporating experimental and / or literature NMR data of Laurencia and Aplysia metabolites. The database is implemented in the interface of ACD/Labs s/w and facilitates the interpretation of 2D HSQC data based on simulation algorithms enhancing the confident discrimination of the secondary metabolites present in the sample. The database includes approx. 300 records comprising structurally diverse compounds from the classes of C15 acetogenins, sesquiterpenes and diterpenes. b) The development of an 'in-house’ Laurencia-focused LC-MS library comprising metabolites isolated in the past from Laurencia in our laboratory c) The rapid detection of two new C15 bromoallene acetogenins in a crude extract of Laurencia chondrioides collected from Kefalonia (marilzallene B and chondrioallene). The obtained results have been published in Kokkotou et al. Phytochemistry, 2014, 108, 208–219. Subsequently, in Chapter 5, an exploratory study comprising 103 Laurencia samples collected across the Greek coastlines investigated the potential of LC-MS/PCA and 1H NMR/PCA untargeted profiling to discriminate patterns among the various Laurencia populations. The major findings of this extended study are summarized in the following: a) The emergence of outlier samples probed to the presence of new natural products b) Two major metabotypes of Greek Laurencia specimens were revealed, metabotype A comprising an array of C15 acetogenins and metabotype B which is mainly sesquiterpenes-oriented. c) Moreover, the study revealed the influence of the marine eco-region (Ionian and Aegean Sea) relatively to the expression of the two metabotypes on Laurencia obtusa specimens. To the best of our knowledge, this is the first untargeted metabolomics study performed on a high number of Laurencia populations. In Chapter 6, a targeted LC-HRMS approach was applied to the collection of Laurencia populations screening for bioactive diterpenes and specifically the diterpene neorogioltriol (NRG) exhibiting strong anti-inflammatory activity which was initially isolated from a Laurencia glandulifera population from Kefalonia, the structural analog neorogioldiol, as well as the congeners neorogioldiol B and prevezols A-E, isolated from a Greek L. obtusa specimen from the coasts of Preveza. These compounds have been proposed to belong to the same biogenetic pathway and thus this LC-HRMS screening targeted to trace any of them or even related analogues. The presence of the target compounds was identified in a population of Laurencia collected from Vatsa bay (south-west coastal region of Kefalonia). Subsequently, collection of individual specimens of the particular Laurencia population allowed for an intra-population study. LC-MS/PCA analysis clearly revealed intra-population variability and discriminated two clusters from the average population, one associated with an array of diterpenes and another one comprising mainly sesquiterpenes. A reverse “V” shaped PCA map and the allocation of the clusters also implied an interplay between the diterpenes and sesquiterpenes abundance, suggesting a cross-talk between the two pathways related to terpenes biosynthesis, namely MEP (methylerythritol) and MVA (mevalonic acid). This cross-talk could account for the favorable biosynthesis of the bioactive diterpenes at the expense of sesquiterpenes. The seasonal variation of Laurencia secondary metabolome was also demonstrated from this study, possibly driven by the changing of environmental conditions or the exposure to pathogens, epiphytes or herbivores with an impact to the production of bioactive diterpenes or sesquiterpenes

Structural bioinformatics studies and tool development related to drug discovery

This thesis is divided into two distinct sections which can be combined under the broad umbrella of structural bioinformatics studies related to drug discovery. The first section involves the establishment of an online South African natural products database. Natural products (NPs) are chemical entities synthesised in nature and are unrivalled in their structural complexity, chemical diversity, and biological specificity, which has long made them crucial to the drug discovery process. South Africa is rich in both plant and marine biodiversity and a great deal of research has gone into isolating compounds from organisms found in this country. However, there is no official database containing this information, making it difficult to access for research purposes. This information was extracted manually from literature to create a database of South African natural products. In order to make the information accessible to the general research community, a website, named “SANCDB”, was built to enable compounds to be quickly and easily searched for and downloaded in a number of different chemical formats. The content of the database was assessed and compared to other established natural product databases. Currently, SANCDB is the only database of natural products in Africa with an online interface. The second section of the thesis was aimed at performing structural characterisation of proteins with the potential to be targeted for antimalarial drug therapy. This looked specifically at 1) The interactions between an exported heat shock protein (Hsp) from Plasmodium falciparum (P. falciparum), PfHsp70-x and various host and exported parasite J proteins, as well as 2) The interface between PfHsp90 and the heat shock organising protein (PfHop). The PfHsp70-x:J protein study provided additional insight into how these two proteins potentially interact. Analysis of the PfHsp90:PfHop also provided a structural insight into the interaction interface between these two proteins and identified residues that could be targeted due to their contribution to the stability of the Hsp90:Hop binding complex and differences between parasite and human proteins. These studies inspired the development of a homology modelling tool, which can be used to assist researchers with homology modelling, while providing them with step-by-step control over the entire process. This thesis presents the establishment of a South African NP database and the development of a homology modelling tool, inspired by protein structural studies. When combined, these two applications have the potential to contribute greatly towards in silico drug discovery research