Intercellular signalling, cell fate and cell shape in the Drosophila pupal wing

The morphogenesis of tissues in animal development is orchestrated by intercellular signalling and executed by cell behaviours such as changes to shape. Understanding the link between signalling and cell shape changes is a key task of developmental biology. This work addresses this problem using the development of the pupal wing of Drosophila melanogaster. The pupal wing is a bilayered epithelium which is patterned into vein and intervein domains, and which secretes the cuticle of the adult wing. I first address the cellular basis of pupal wing development, and show that the process comprises a series of dynamic cell shape changes involving alterations to the apical and basolateral surfaces of the cells. Using temporally controlled mis-expression, I then investigate the role of intercellular signalling in these shape changes, and define the competence of cells in the wing to respond to ectopic signals. The dimensions of signalling in the pupal wing are then investigated, and I show that while BMP ligands can travel between the layers to promote vein development, such signalling is not a prerequisite for cellular differentiation. Within the plane of the epithelium, the BMP ligand Dpp can only induce signalling at a short range, potentially due to the upregulation of receptor levels in receiving cells. Finally, attention is turned to the means by which cell signalling controls cell shape changes, specifically in the crossveins. I identify the RhoGAP Cv-c as a downstream target of BMP signalling which acts to inhibit a novel RhoGTPase function in intervein development. This provides an example of how signalling pathways can enact cell shape changes, via the transcriptional regulation of RhoGAP

Logical Modeling and Analysis of Cellular Regulatory Networks With GINsim 3.0

The logical formalism is well adapted to model large cellular networks, in particular when detailed kinetic data are scarce. This tutorial focuses on this well-established qualitative framework. Relying on GINsim (release 3.0), a software implementing this formalism, we guide the reader step by step toward the definition, the analysis and the simulation of a four-node model of the mammalian p53-Mdm2 network

Update schemes and other extensions to support logical modelling of multicellular systems

Tese de Mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO estado de uma célula é controlado por vários componentes biológicos, como genes, proteínas, metabólitos, que interagem entre si, criando grandes redes regulatórias. Os componentes dessas redes não só regulam os outros componentes, como também a si próprios, fazendo-o através de fatores de transcrição, fosforilação, entre outros. Vários formalismos foram usados para modelar este tipo de redes, entre eles está o formalismo lógico, que representa uma rede regulatória como um grafo, onde os vértices correspondem a componentes biológicos e as arestas às interações entre estes. Este formalismo é especialmente bem sucedido no estudo deste tipo de redes devido à abstração do componente num vértice que permite que este represente qualquer tipo de componente biológico, refletindo assim a complexidade biológica inerente a estas redes. Também o tipo de interação é abstraído, considerando apenas o impacto da interação, se é positiva ou negativa. O modelo lógico é caracterizado por tradicionalmente considerar apenas dois valores para os seus componentes, a sua ausência (0) ou a sua presença (1). O valor de cada componente é regulado por uma função lógica dependente dos componentes que o regulam, esta função lógica representa as interações antagônicas, acumulativas, entre outras, no componente regulado. O estudo dos sistemas biológicos estende-se também à consideração de sistemas multicelulares. A dinâmica destes sistemas leva à formação de padrões devido à interação (sinalização) entre células. Estes padrões resumem-se a organizações espaciais de células que atingem estados estáveis (estados de onde qualquer célula não consegue sair). O EpiLog (Epithelium Logical modelling) é uma ferramenta informática desenvolvida em Java, com interface gráfica, utilizada para estudar a formação de padrões sobre um epitélio. Este epitélio é modelado por um autómato celular, composto por uma matriz de células hexagonais, onde o estado de cada célula é controlado por um modelo lógico. A implementação e simulação dos modelos lógicos é feita pela biblioteca bioLQM, utilizado pelo EpiLog. O autómato celular, framework usada pelo EpiLog, é um formalismo discreto usado para estudar propriedades de auto-organização emergentes das interações entre os autómatos. Consiste numa matriz de autómatos onde o valor zero ou um associado a cada célula (ou autómato) é regulado pelas interações com os seus vizinhos próximos. O EpiLog estende esta definição ao associar modelos lógicos a cada célula, o que permite uma representação mais complexa do estado da célula. Também a definição de vizinhança é alterada para permitir a modelação de sinalização entre células não adjacentes, representando a sinalização parácrina. A dinâmica de um modelo lógico é influenciada pela escolha do esquema de atualização. O esquema de atualização determina a ordem pela qual os valores dos componentes dos modelos são atualizados, isto é, a ordem pela qual a função de regulação é aplicada. O EpiLog faz a atualização das suas células do epitélio considerando “classes de prioridade”. Este esquema define que os componentes dos modelos se dividam em classes com ranks associados, de tal modo que os componentes pertencentes a classes com ranks mais baixos não são atualizados enquanto existirem componentes de classes com ranks mais elevados que sejam atualizáveis. As classes em si são atualizadas de forma síncrona, isto é, os componentes pertencentes à mesma classe são atualizados simultaneamente, gerando um único sucessor. Do ponto de vista biolófico, o esquema de atualização síncrono não faz sentido, visto implicar que todos os vários processos biológicos aconteçam com a mesma taxa de velocidade. Este pressuposto leva a artefatos de modelação que não correspondem ao observado in vivo. Por oposição ao esquema de atualização síncrono, o assíncrono atualiza cada componente individualmente, criando tantos sucessores quanto o número de componentes que possam ser atualizados. O foco principal desta tese é a implementação de novos esquemas de atualização que introduzem alguma assincronicidade dentro das classes de prioridades, com o objetivo de mitigar e explorar as fragilidades do esquema de atualização síncrona. A implementação é feita no bioLQM, onde as classes são compostas por grupos, sendo que estes têm um esquema de atualização associado, os sucessores da classe são a união dos sucessores dos grupos da classe. O EpiLog limita uma classe a apenas um grupo, tornando os dois essencialmente sinónimos. Os novos esquemas de atualização dividem-se em sucessores múltiplos e sucessores únicos, EpiLog usa apenas os segundos, sendo estes o uniformemente aleatório e não uniformemente aleatório. O esquema uniforme aleatório corresponde à escolha aleatória de um sucessor entre os sucessores resultantes de um esquema assíncrono, enquanto o esquema não uniforme aleatório implica que seja atribuído a cada componente uma probabilidade de ser atualizado, e o sucessor final é escolhido dos sucessores assíncronos com base nessa probabilidade. Ambos os esquemas permitem que um maior número de trajetórias seja explorado, as resultantes do esquema assíncrono, o esquema de atualização não uniforme aleatório permite também integrar conhecimento cinético sobre as interações do sistema, levando à exploração de trajetórias em teoria com maior significado biológico. A utilidade dos novos esquemas foi testada através de um caso de estudo, um modelo lógico já publicado do módulo de genes segment polarity, que consolida os segmentos do embrião da Drosophila. É mostrado que os novos esquemas de atualização permitem obter a maioria dos padrões estáveis obtidos na publicação original ao contrário do esquema síncrono inicial. São testadas várias mutações além do caso wild-type, e são considerados dois epitélios: um único segmento de seis células, e um epitélio de 12 por 12 células. O primeiro epitélio corresponde à situação modelada na publicação original, e a replicação dos resultados foi conseguida com ambos os esquemas de atualização “duas classes com uniforme aleatório” e apenas “não uniforme aleatório” (ou seja uma classe). Este resultado demonstra a necessidade da introdução da assincronicidade nos esquemas de atualização. No epitélio de 12 por 12 células devido ao grande número de células (12×12) e consequentemente ao número elevado de estados possíveis, foi necessário definir um esquema de atualização mais restrito, o “duas classes com não uniforme aleatório” para obter os mesmos resultados. Este último resultado mostra a utilidade da combinação dos novos esquemas de atualização com as classes de prioridade, que oferecem ao modelador maior flexibilidade e controlo sobre que trajetórias explorar. Também é mostrado que com a implementação dos novos esquemas, o EpiLog está mais apto para modelar grandes epitélios, sendo assim uma melhor ferramenta no estudo de formação de padrões em sistemas multicelulares. Uma vez que os novos esquemas de atualização foram implementados no bioLQM, favorecem não só o EpiLog, como também todas as ferramentas dependentes do bioLQM. Estas ferramentas ganham agora classes de prioridades que permitem a definição de vários grupos numa classe, e esquemas de atualização de grupos que aceitam esquemas de atualização com sucessores múltiplos além de únicos. Além da implementação dos novos esquemas de atualização, foram adicionadas duas outras funções ao EpiLog, com o objetivo de tornar mais completa e fácil a experiência de modelação do utilizador. A primeira, chamada “phenotype tracking”, foi motivada pela necessidade de uma visão alternativa e complementar ao output do EpiLog, que se foca ao nível do epitélio, dando uma representação gráfica do estado do mesmo (onde o estado das interno células pode ser consultado ao ser clicado). Esta nova ferramenta gera uma série temporal dos estados internos das células ao longo de uma simulação, o que melhora o entendimento do utilizador sobre os resultados de uma simulação. É também possível definir sobre que estados a informação será gerada, isto é, a definição de fenótipos que consistem em conjuntos de estados da célula (do modelo lógico) que caracterizam uma célula. Os fenótipos são definidos pelo utilizador dependente do interesse biológico que lhe atribui. Foi também implementada uma maneira alternativa de editar as definições de um epitélio, que permite ao utilizador fazê-lo de forma textual, evitando o uso da interface gráfica. Esta adição é indicada para utilizadores mais experientes, permitindo assim uma edição mais rápida e eficiente.The state of a cell is controlled by a regulatory network of biological components. The logical formalism is a powerful discrete framework to model these networks, as it abstracts the type of biological components capturing the nature, positive or negative, of their interactions. Cell-cell signalling results in pattern formation through the acquisition of distinct cellular phenotypes. This work focuses on the logical modelling of multi-cellular systems, accounting for cell-cell signalling. EpiLog is a Java tool for studying pattern formation of an epithelium, modelled by a cellular automaton, composed of a two-dimensional grid of hexagonal cells, where logical models govern their internal states. The dynamics of the cellular logical model are simulated by the bioLQM toolkit, used by EpiLog. The model dynamics are influenced by updating schemes, which set the order of the model components updates. EpiLog uses priority synchronous classes, where all the class components are updated simultaneously. Synchronous updating unrealistically assumes that all processes occur at the same time, producing modelling artefacts. This thesis implements new updating schemes to mitigate the drawbacks of the synchronous update, by introducing some asynchronicity. The usefulness of the new updating schemes is confirmed with a case study, a published logical model of the segment polarity module, which consolidates the fly embryo segments. We show that the new updating schemes capture most of the stable patterns obtained in the original publication, and that EpiLog with these new updaters is thus more suitable to study pattern formation in multi-cellular systems. Additionally, two features were implemented. The user can now better assess simulation results thanks to the generation of data concerning the cell states along the simulation. Furthermore, the possibility to edit model definitions rather than doing so through the GUI facilitates the work of the advanced users

The role of Notch-signalling in avian thymus and parathyroid glands development

The thymus generates central immune tolerance by producing self-restricted and self-tolerant T-cells, while the parathyroid glands regulate extracellular calcium homeostasis through the production of the parathyroid hormone (Pth). Despite their functional differences, they share a common endodermal origin in the pharyngeal region, which in avian corresponds to the endoderm of the 3rd and 4th pharyngeal pouches (3/4 PP). The involvement of several transcription factors and signalling pathways (including the Hedgehog pathway) during the early stages of thymus and parathyroid glands (T/PT) development has been reported over the years. However, the molecular mechanisms and interactions between major signalling pathways regulating their early development are still poorly understood. Namely, the potential contribution of Notch signalling – one of the major pathways involved in cell-fate determination and boundary formation – at these early stages remains unknown. Recently, and using the avian model, we observed the expression of Notch-related molecules in the presumptive territories of T/PT. In addition, during my master’s thesis I showed that the pharmacological inhibition of Notch signalling at these stages of T/PT development blocked Gcm2 (parathyroid marker) and altered Foxn1 (thymic marker) expressions, detected through in situ hybridization. These data suggest a potential role of Notch signalling during thymus and parathyroid glands early development. In addition, Notch and Hedgehog pathways have been shown to interact in several biological contexts. In this thesis, we investigated the role of Notch signalling at the early stages of T/PT development, and its possible interaction with Hedgehog in this context. Using the quail-chick developmental model and pharmacological inhibitors in vitro and in vivo, we show, for the first time, that Notch is crucial for T/PT common primordium development and for parathyroid formation. Notch signalling was found to be required (within a 48h time-window) for the normal expression of Foxn1 and Gcm2 at early stages of development. Moreover, Notch signals within this time-window were found to be crucial for parathyroid glands formation. We also show that Hedgehog acts upstream of Notch during T/PT early development. Hedgehog positively regulates the median domains of the pouch endoderm – the Gata3+/Gcm2+ anterior domain and the Lfng+ posterior domain – which seem to be more Hedgehog-responsive than the pouch tips, namely the dorsal tip where the thymus is formed. In addition, we provide evidence that the Lfng-expression domain is involved in the definition of the dorsal/posterior boundary of Foxn1/thymic rudiment. To clarify the tissue-specific role of Notch signalling at the early stages of T/PT development, isolated quail 3/4PP endoderm was electroporated with a Tol2-mediated gene transfer and tetracycline-dependent conditional expression system of vectors generated during my master thesis to induce loss- and gain-of-function of Notch signalling. A new loss-of-function construct (pT2K-NLS-Cherry-DNMAML1-eGFP) was also developed. However, the results obtained using the tested conditions were inconclusive, limiting the analysis of tissue-specific roles of Notch signalling in T/PT development during this thesis. This work provides new insights into the role of Notch signalling in T/PT early development, and into the interactions between major signalling pathways that regulate this development. However, which tissue – the endoderm or the surrounding mesenchyme – is the main driver of these Notch effects remains unanswered

Wnt/β-kateninová signalizace ve vývoji mořského kroužkovce Platynereis dumerilii

Radim Žídek "Wnt/β-kateninová signalizace ve vývoji mořského kroužkovce Platynereis dumerilii" (disertační práce) Abstrakt: Wnt/β-kateninová signalizace je zásadní pro raný embryonální vývoj mnohobuněčných živočichů, od ustavení tělních os, přes určení zárodečných listů a tkání až po vývoj orgánových soustav. Použil jsem farmakologické ovlivnění aktivity Wnt/β-kateninové dráhy u planktonních larev mořského mnohoštětinatého kroužkovce, nereidky Platynereis dumerilii, zástupce skupiny Spiralia, abych prošetřil úlohu Wnt/β-kateninové signalizace ve vývoji a evoluci tří charakteristických znaků dvoustraně souměrných živočichů (Bilateria): centrální nervové soustavy, tělního článkování a trávicí trubice. Wnt proteiny jsou u nereidky produkovány ve všech tří výše zmíněných soustavách, kde spouští Wnt/β-kateninovou dráhu v sousedních buňkách. Vůbec poprvé zde u nereidky popisuji homolog koncového transkripčního faktoru celé dráhy, Pdu-Tcf, který je předmětem alternativního sestřihu a spolu s cílovým genem Wnt signalizace, Pdu-Axinem, exprimován v tkáních s aktivní Wnt signalizací - v mozkových gangliích, v neuroektodermu podél břišní středové linie, v článcích, v posteriorní růstové zóně a ve střevě. Farmakologické manipulace naznačují, že Wnt/β-kateninová signalizace v ektodermu nereidky specifikuje progenitory...Radim Žídek "Wnt/β-catenin signalling in the development of the marine annelid Platynereis dumerilii" (dissertation) Abstract: Wnt/β-catenin signalling is absolutely crucial for the early embryonic development of metazoan animals from the establishment of body axes, through the specification of germ layers and tissues to the development of organ systems. I used pharmacological manipulations of the Wnt/β-catenin pathway activity in the planktonic larvae of the marine polychaete annelid Platynereis dumerilii, the representative of the clade Spiralia, to investigate the role of Wnt/β- catenin signalling in the development and evolution of three hallmarks of Bilateria: the central nervous system, the body segmentation and the digestive tube. Wnt proteins are produced in all three aforementioned systems in Platynereis where they trigger the Wnt/β-catenin pathway in neighbouring cells. I describe here, for the first time in Platynereis, a homologue of the endpoint transcription factor of the entire pathway, Pdu-Tcf, which is subjected to an alternative splicing and along with a Wnt target gene Pdu-Axin is expressed in tissues with the active Wnt signalling - in the brain ganglia, in the neuroectoderm along the ventral midline, in segments, in the posterior growth zone and in the gut. Pharmacological manipulations...Katedra buněčné biologieDepartment of Cell BiologyFaculty of SciencePřírodovědecká fakult

Tumor Angiogenesis

Tumor angiogenesis is the main process responsible for the formation of new blood vessels that promote tumor growth and metastasis. This process is driven by potent pro-angiogenic factors that are predominant in the tumor environment and are produced by both malignant cells and the host cells recruited to the tumor site. Tumor environment is characterized by the imbalance between pro-angiogenic and anti-angiogenic factors, which drives the construction of numerous but structurally defective vessels. These poorly perfused and abnormal vessels significantly contribute to the tumor pathology not only by supporting the expansion of the tumor mass but also by promoting chronic inflammation, enhancing thrombosis, impeding drug delivery, and disseminating tumor cells. These problems associated with tumor vasculature continue to attract great attention of scientists and clinicians interested in advancing the understanding of tumor biology and development of new drugs. This book complies a series of reviews that cover a broad spectrum of current topics related to the pathology of tumor blood vessels including mechanisms inducing new vessels, identification of new targets for inhibition of tumor angiogenesis, and potential clinical use of known and novel anti-angiogenic therapies. The book provides an update on tumor angiogenesis that could be useful for oncologists, cancer researchers and biologists with interests in vascular and endothelial cell behavior in the context of cancer