Mimotopes for therapy of grass pollen induced asthma

Die Immuntherapie mit Allergenen ist heute noch immer mit unerwünschten Nebenwirkungen assoziiert. Zum Teil ist dies bedingt durch die Induktion von anaphylaktogenen Antikörpern, die gegen irrelevante Moleküle oder gar irrelevante Epitope der eingesetzten Allergene gerichtet sind. Dies könnte durch epitopspezifische Immuntherapie verhindert werden, bei der Mimotope oder anti-idiotypische Antikörper mit Mimikry-Potential (Review in Chapter I) anstelle von Allergenen eingesetzt werden. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Mimotoptherapie gegen Gräserpollenallergie weiter zu optimieren und die hierfür notwendigen proof of concept Experimente zu etablieren und durchzuführen. Im ersten experimentellen Ansatz (Chapter II), wurde ein Mausmodell für allergisches Asthma für die Sensibilisierung mit dem Graspollen-Hauptallergen Phl p 5 adaptiert. Akutes Asthma wurde durch systemische Sensibilisierung, gefolgt von inhalativer Exposition mit dem Allergen induziert, wodurch Mukussekretion, Lymphfollikelbildung und eosinophile Entzündung der Atemwege ausgelöst wurden. Um zwischen allergischem Asthma und un-spezifisch getriggerter Hyperreagibilität zu unterscheiden, fügten wir noch Ovalbumin (OVA) als ein irrelevantes Kontrollallergen für die Aerosolisierung von Phl p 5-allergischen Mäusen hinzu. In einem neuartigen Ansatz führten wir Analysen des Austausches der Atemgase mithilfe indirekter Kalorimetrie vor und nach Provokationen mit aerosolisierten Antigenen durch. Verstärkte Atmung konnte nach 48 Stunden nur in der mit Phl p 5 nebulisierten Mausgruppe festgestellt werden, charakterisiert durch erhöhte O2 Konsumation und CO2 Freisetzung in die Ausatemluft. Obwohl die Atemwegsentzündung der mit OVA provozierten Gruppe generell schwächer als in Mäusen mit allergischem Asthma war, zeigten beide Gruppen eine signifikante Abnahme der motorischen Aktivität und wiesen Azidose kombiniert mit einem prägnanten Abfall von roten und weißen Blutkörperchen in der Peripherie auf, gepaart mit deren Umverteilung in die Lunge. Daher ist die pathophysiologische Relevanz dieses Mausmodells erwiesen. Es dient aus diesem Grund nicht nur der Erforschung der Mechanismen von allergeninduziertem Asthma versus nicht-spezifischer Atemwegsprovokation, sondern eignet sich auch für proof of concept Studien von Mimotopvakzinen. Folglich zeigt Chapter III einen Ansatz, bei dem solchermaßen sensibilisierte Phl p 5-asthmatische Mäuse zur therapeutischen Vakzinierung mit einem synthetisch hergestellten Mimotop gekoppelt an KLH, eingesetzt wurden. Als Mimotop-behandelte Mäuse mit dem aerosolisierten Phl p 5 re-exponiert wurden um die Allergenexposition in der Pollensaison beim Menschen nachzuahmen, wiesen diese eine signifikant geringere Zahl an Eosinophilen in der Bronchoalveolarlavage und im peribronchiolaren Gewebe, sowie eine beeindruckende Herunterregulation der Mukusproduktion im Vergleich zu den „sham“-behandelten Tieren oder zu Mäusen, die nur mit KLH behandelt wurden, auf. Um die Mimotoptechnologie weiter zu verbessern, konstruierten wir in Chapter IV eine Minigen Vakzine, indem wir das im Asthmamodell verwendete Peptidmimotop in eine DNA Vakzine übersetzten. Wir verglichen parallel zwei verschiedene Verabreichungswege für die Immunisierung mit der Genvakzine. Die Applikation mit der Gene gun war mehr mit einer Th2 –ausgerichteten Immunantwort assoziiert. Im Gegensatz dazu wurde durch intradermale Injektion des Minigenkonstruktes keine IgE Antwort induziert, sondern die Produktion blockierender IgG Antikörper ausgelöst, welche das allergenvermittelte Crosslinking von Effektorzell-gebundenem IgE inhibieren konnten. Darüber hinaus konnte keine Proliferation und Zytokinproduktion von allergen-spezifischen T-Zellen beobachtet werden. Die präklinischen Befunde welche in dieser Doktorarbeit erhoben wurden deuten darauf hin, dass Mimotope in Peptid oder DNA Form therapeutisches Potential für die Behandlung von allergischen Erkrankungen, im besonderen Asthma, besitzen. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Mimotope ausschließlich Allergen- B-Zellepitope repräsentieren, jegliche Aktivierung pro-inflammatorischer T-Lymphozyten jedoch ausgeschlossen werden kann.Allergen immunotherapy is today still associated with undesired side effects. This is in part due to the induction of anaphylactogenic antibodies directed against irrelevant molecules or even irrelevant epitopes within the applied allergens. This could be avoided by epitope-specific immunotherapy using mimotope peptides or anti-idiotypic Fab fragments with mimicry potential (reviewed in Chapter I) instead of allergens. This thesis aimed to further optimize mimotope immunotherapy against grass pollen allergy, and to set up and perform the necessary proof of concept studies. Therefore, in the first experimental approach (Chapter II), a mouse model of allergic asthma was adapted to sensitization with grass pollen major allergen Phl p 5. Acute asthma was induced via systemic sensitization followed by inhalative allergen challenge rendering mucus secretion, lymphoid follicle formation and eosinophilic inflammation of the airways. To discriminate allergic asthma from non-specifically triggered airway hyperreactivity, we added ovalbumin (OVA) being an irrelevant control antigen for aerosolization of Phl p 5-allergic mice. In an innovative approach we performed respiratory gas exchange measurements by indirect calorimetry before and after challenges with aerosolized antigens. Enhanced respiration was found up to 48 hrs after provocation in the Phl p 5-nebulized mouse group only, characterized by significantly increased consumption of O2 and release of CO2 into exhaled air. Although airway inflammation of the OVA challenged group was overall milder than in mice with allergic asthma, both groups showed significantly less motor activity and exhibited acidosis combined with a sharp decline of white and red blood cells shown to be redistributed to the lung. This mouse asthma model therefore proved to be of pathophysiological relevance, being suitable not only for exploring the mechanisms of allergen- induced asthma versus non-specific airway provocation, but importantly also for proof of concept studies for mimotope vaccines. Consequently, Chapter III shows an approach using in such a way sensitized Phl p 5-asthmatic mice for therapeutical vaccination with a synthetic peptide mimotope linked to carrier KLH. When mimotope-treated mice were then re-exposed with the aerosolized Phl p 5 to mimic allergen re-exposure of humans in the pollen season, they exhibited significantly lower eosinophil numbers in the bronchoalveolar lavage and peribronchiolar tissue as well as an impressive downregulation of mucus production as compared to sham-treated animals or animals treated with KLH only. To further improve mimotope technology, we constructed in Chapter IV a minigene vaccine by translating the same peptide mimotope as used in the asthma model into a DNA vaccine. We compared head to head two different administration routes for immunization with the gene vaccine. Whereas gene gun bombardment was found to be associated with a Th2 biased immune response, intradermal injection did not induce IgE production but rendered blocking IgG antibodies able to inhibit allergen-mediated crosslinking of effector cell-bound IgE. In addition, no proliferation and cytokine production of allergen-specific T cells were observed. The pre-clinical evidence collected in this thesis work suggests that mimotopes in peptide or DNA form have therapeutic potency for the treatment of allergic diseases. This is possibly due to the fact that they represent pure B cell-epitope mimics and completely avoid the activation of any pro-inflammatory T-lymphocytes

Molecular and immunological characterization of wheat allergens

Bäcker Asthma bezeichnet eine IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktion, die durch Inhalation von Weizenmehl ausgelöst wird. Der Begriff weist auf eine berufsbezogene Erkrankung hin, von denen 4-25% betroffen sind. Das Erkennen des auslösenden Allergens und die Vermeidung der Allergenbelastung könnte die Symptome verringern. In der Vergangenheit konnten viele Allergene isoliert werden, aber es sind keine Tests verfügbar um zwischen der Weizen-abhängigen Nahrungsmittelallergie und Bäcker Asthma zu unterscheiden. Constantin et al. präsentierte in ihrer kürzlich publizierten Studie einen Allergen-Microarray basierend auf gereinigten, rekombinanten Proteinen. Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung weiterer Allergene, die in Bäcker Asthma involviert sind, trägt zu einer Verbesserung der Methodik bei, welche sich zu einer effektiven Methode für die Krankheitsdiagnose in der Zukunft entwickeln könnte. Bezogen auf diese Vorstellung, war das Hauptziel meiner Diplomarbeit die molekulare, strukturelle und immunologische Charakterisierung von neuen Allergenen, die an Bäcker Asthma beteiligt sind. Die isolierten IgE-reaktiven cDNA Klone konnten durch Sequenzanalysen folgendermaßen identifiziert werden: Thioredoxin h (Klon 37), Glutathiontransferase (Klon 38), 1-Cysperoxiredoxin (Klon 112), Profilin (Klon 123) und Dehydrin (Klon 126). Die rekombinanten Proteine wurden in E.coli als C-terminal hexahistidin-markierte Proteine exprimiert und das Molekulargewicht wurde ermittelt. Ein Dot-Blot Experiment wurde durchgeführt um die IgEReaktivität der rekombinanten Proteine zu untersuchen. 1-Cys-peroxiredoxin wurde stark von Serum-IgE von 35.7% der Patienten, die an Bäcker Asthma leiden, erkannt. Darüber hinaus konnte mittels Untersuchung der Histaminfreisetzung eine stark allergene Wirkung in 21% der Patienten nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde Thioredoxin h von keinen der Allergiker erkannt und keine Histaminfreisetzung induziert. Es gibt einen Bedarf an rekombinanten Weizenallergenen, die speziell von Bäcker Asthma Patienten erkannt werden, um die Diagnose zu verbessern, die Notwendigkeit von Provokationstests zu verringern und sie möglicherweise in der Immuntherapie von IgEvermittelten Allergie einsetzen zu können.Baker’s asthma is an IgE-mediated hypersensitivity disease caused by inhalation of wheat flour. The term still indicates the problem specific to a particular profession, from which 4- 25% are affected. Identification of the workspace agent could minimize the symptoms by avoiding exposure to the allergen. In the past, many allergens could be isolated, but there is no test available to discriminate between wheat-dependent food allergy and Baker’s asthma. Constantin et al. presented in a recently published study an allergen microarray based on purified recombinant proteins. Further isolation, identification and characterization of allergens involved in Baker’s asthma will improve this method which could become an effective tool for the diagnosis of the disease in the future. Based on this idea, the main aim of my diploma thesis was the molecular, structural and immunological characterization of new allergens involved in Baker’s asthma. The isolated IgE-reactive cDNA clones could be identified by sequence analysis as follows: Thioredoxin h (clone 37), Glutathione transferase (clone 38), 1-Cys-peroxiredoxin (clone 112), Profilin (clone 123) and Dehydrin (clone 126). Recombinant proteins were expressed in E.coli as C-terminally hexahistidine-tagged proteins and the molecular weight was determined. A dot-blot experiment which is an effective method to study IgE-reactivity of recombinant proteins, was performed. 1-Cys-peroxiredoxin was strongly recognized by serum IgE from 35.7% of patients suffering from Baker’s asthma. Furthermore, in histamine release assays, an important method for evaluating allergenicity of allergens, we could show strong allergenic activity in 21% of patients. In contrast, thioredoxin h was recognized by none of the allergics and only induced a weak degranulation in the histamine release assay. There is a need of recombinant wheat allergens, specifically recognized by baker’s asthma patients, to use them for diagnosis, reduce provocation testing and possibly immunotherapy of IgE-mediated allergy

A Software Product Line Approach to Ontology-based Recommendations in E-Tourism Systems

This study tackles two concerns of developers of Tourism Information Systems (TIS). First is the need for more dependable recommendation services due to the intangible nature of the tourism product where it is impossible for customers to physically evaluate the services on offer prior to practical experience. Second is the need to manage dynamic user requirements in tourism due to the advent of new technologies such as the semantic web and mobile computing such that etourism systems (TIS) can evolve proactively with emerging user needs at minimal time and development cost without performance tradeoffs. However, TIS have very predictable characteristics and are functionally identical in most cases with minimal variations which make them attractive for software product line development. The Software Product Line Engineering (SPLE) paradigm enables the strategic and systematic reuse of common core assets in the development of a family of software products that share some degree of commonality in order to realise a significant improvement in the cost and time of development. Hence, this thesis introduces a novel and systematic approach, called Product Line for Ontology-based Tourism Recommendation (PLONTOREC), a special approach focusing on the creation of variants of TIS products within a product line. PLONTOREC tackles the aforementioned problems in an engineering-like way by hybridizing concepts from ontology engineering and software product line engineering. The approach is a systematic process model consisting of product line management, ontology engineering, domain engineering, and application engineering. The unique feature of PLONTOREC is that it allows common TIS product requirements to be defined, commonalities and differences of content in TIS product variants to be planned and limited in advance using a conceptual model, and variant TIS products to be created according to a construction specification. We demonstrated the novelty in this approach using a case study of product line development of e-tourism systems for three countries in the West-African Region of Africa

Feasibility studies for development of specific re-loadable binding sites for drug delivery systems immobilized onto implant surfaces

Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines neuartigen biokompatiblen Beschichtungssystems für medizinische Implantatmaterialien, die Bindungsstellen für bioabbaubare, mit Wirkstoffen beladene Nanopartikel (Drug Carriers) tragen. Diese Wirkstoffe werden während des Abbaus der Drug Carriers dort kontrolliert freigesetzt. Nach dem Abbau der Partikel sind diese Bindungsstellen wieder frei um mit neuen Drug-Carriers beladen zu werden. Zum Erreichen dieses Ziels wurden als Testsystem die Implantatmaterialien Edelstahl und Zirkon-Keramik verwendet. Zur Verbesserung der Biokompatibilität wurde ein sogenanntes Passivcoating mit Polymeren wie z.B. dem medizinisch zugelassenen Polyethylenglykol (PEG) aufgebracht, um eine Schutzschicht zu bilden. Außerdem wurde ein geeignetes Rezeptorsystem zu verankert, das in der Lage ist, biodegradable mit Wirkstoffen beladene Mikro- oder Nanopartikel (Drug Carriers) zu binden, um eine lokale pharmakologische Wirkung zu erzielen (Aktives Coating). Zu diesem Zweck wurden spezielle Antikörper bzw. auch Antikörper-Fragmente als Capture-Moleküle an die Oberfläche des Implantatmaterials gebunden. Zur Herstellung der Drug Carriers wurden sowohl ein Copolymer aus Milch- und Glycolsäure (PLGA) als auch Chitosan verwendet. Die Drug Carriers werden dann entweder durch Hydrolyse oder mit Hilfe von Enzymen im Blut (Hydrolyse für PLGA, Lysozym für Chitosan) abgebaut und setzten die in ihnen enthaltenen Wirkstoffe lokal frei. Nach dem vollständigen Bioabbau liegen die Capture-Moleküle wieder frei vor und können mit neuen Drug Carriers beladen werden, womit ein vollkommen neuartiges System für Wirkstoffabgabe von medizinischen Implantaten zur Verfügung steht. Solche Beschichtungen können die Basis für eine Vielzahl von Anwendungen sein, die eine gezielte Wirkstoffabgabe an der Grenzfläche zwischen Implantat und gesundem Gewebe erfordern. Bei Bedarf können die Drug Carriers in die Blutbahn injiziert werden, binden an das Rezeptorsystem auf der Implantatoberfläche und setzen im Zuge ihres Abbaus die Wirkstoffe frei. Da sie mit unterschiedlichen Wirkstoffen beladen werden können, ermöglichen sie eine patientenspezifische Anpassung der Medikation, aber auch die Gabe von Wirkstoffen, die sonst zu rasch abbaubar oder schwierig zu dosieren wären. Der analytische Nachweis des erfolgreichen chemischen Setups mit Hilfe optischer Methoden erwies sich als schwierig auf Grund von Quenching Effekten im Fall von Metall bzw. wegen der rauen Oberfläche bei Zirkon (Keramik). Daher wurde die spezifische Bindung der Nanopartikel an der Implantatoberfläche an Glasoberflächen mit gleicher chemischer Beschichtung mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie getestet. Außerdem mussten für den Nachweis des erfolgreichen chemischen Aufbaus und der biorecognitiven Bindung verschiedene neue analytische Tests entwickelt und evaluiert werden. Ein schwieriges Problem, das in dieser Arbeit gelöst werden musste, war das Finden eines brauchbaren Biorekognitionssystems für das Binden der biokompatiblen Drug Carrier Nanopartikel. Es braucht spezielle Lösungsansätze, um Antikörperbildung gegen biokompatible Materialien zu induzieren. Im Fall von Chitosan, waren Antikörper kommerziell erhältlich, während für PLGA ein sehr stringentes Immunisierungsprotokoll in Kaninchen entwickelt werden und auch Probleme hinsichtlich Reinigung und Titerbestimmung gelöst werden mussten. Durch die durchgeführten Experimente war es möglich ein „Proof of concept“ für ein wiederbeladbares Targeting-system zur lokalen Medikamentenfreisetzung an Oberflächen zu geben. Dieses neuartige System ist eine Basis für ein breites Anwendungsgebiet in der regenerativen Medizin wie z.B. Stents, artifizielle Knochenimplantate und andere künstliche Gewebe, die eine lokale und kontrollierte Medikamentenfreisetzung an der Grenzfläche zwischen Implantat und gesundem Gewebe benötigen. Das Drug-Delivery System schützt die eingeschlossenen Wirkstoffe vor vorzeitigem Abbau – wichtig z.B. bei Wachstumsfaktoren und Immunsuppressiva und erleichtert auch den Transport von schwer absorbierbaren oder schwer löslichen Wirkstoffen zum erwünschten Wirkort. Dank der hohen lokalen Wirkstoffkonzentration wird die Absorption schwerlöslicher Substanzen verbessert, wodurch unerwünschte systemische Nebenwirkungen vermindert werden können.The overall objective of this thesis is to develop novel, bio-compatible coatings for medical implant materials with binding sites for bio-degradable nanoparticles that may serve as drug carriers. The drugs are released gradually during decomposition and after particle degradation the binding sites can be reloaded with new drug delivering particles. To achieve this goal, we used stainless-steel and zirconia as test implant materials. To improve biocompatibility of these materials a so called “passive coating” procedure is used where biocompatible polymers such as polyethyleneglycol (PEG) act as a barrier. Furthermore a specific receptor system was introduced for binding drug containing biodegradable nano- or micro-particles to mediate local pharmacological activity, the so called active coating. For this purpose specific antibodies or antibody-fragments were generated and coupled to the implant material surface as capture molecules for the drug releasing particles. Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) and chitosan were used to produce these biodegradable nanoparticles. The particles are then degraded either by hydrolysis or by means of enzymes circulating in the bloodstream (mere hydrolysis for PLGA and lysozyme for chitosan) while releasing the drugs locally. After complete biodegradation the receptor system is then free again for reloading with new particles containing the respective drugs, making this a completely new mean of drug administration on medical implants. Such coatings can be the basis for a number of applications that require controlled, local drug delivery at the interface between an implant and healthy tissue. Upon the need for medication, drug-loaded nanoparticles can be injected into the bloodstream, bind to the particle-specific antibodies on the target implant and gradually release their drug content during degradation. As nanoparticles can be loaded with different drugs, this technology allows easy adjustment to patient-specific medication needs as well as the administration of compounds that are easily degradable or difficult to dose. Analytical proofs of principle on these materials have proved to be difficult, as the currently available optical methods for testing the successful chemical setup could not be applied because of quenching effects on metal surfaces and the rough surface of zirconia (ceramics). Therefore specific binding of the nanoparticles onto the implant surface was tested on glass substrates, coated similarly as the implant materials, by means of fluorescence microscopy. Furthermore for proof of the successful chemical setup and biorecognitive binding several new analytical test methods had to be developed and evaluated. One of the major challenges we had to overcome was to find suitable biorecognitive systems for binding of the drug containing particles, as these have to be biocompatible too. Special efforts were made to identify and generate specific antibodies against biocompatible materials. In case of chitosan, antibodies were commercially available, whereas for PLGA a very stringent immunisation protocol had to be developed for antibody production in rabbits, in addition to optimization of the purification and titer determination protocols. Using these tools, we were able to perform specific experiments that demonstrate a proof of concept for the possibility to generate a reloadable targeting device for local drug release and potential of our approach in targeted drug delivery and release. This new system provides the basis for a wide array of applications in regenerative medicine such as stents, implants of artificial bones and other artificial tissues, requiring local drug action at the interface between an implant and healthy tissue in a controlled manner. The delivery system protects the incorporated drugs from degradation prior to action e.g. growth factors and immunosuppressives, and facilitates the transport of poorly absorbable or insoluble drug candidates to the intended site of action. Due to the high local drug concentration, the absorption rate of poorly soluble drug molecules will be improved, which would significantly reduce undesired, adverse systemic effects. Furthermore after implantation also a change of drugs is possible, as with each reloading procedure appropriate drugs according to patients needs may be chosen

IMMUNOLOGY IN CROATIA 40th anniversary of the Croatian Immunological Society

This special issue is dedicated to the 40th Anniversary of organized activities of the Croatian Immunological Society. On this occasion the Annual Meeting of Croatian Immunological Society will be organized in [ibenik, October 9-12 2008, where this supplement will be introduced and distributed. The idea for such a collection of data was born (conceived) during my first presidency 10 years ago, when the first account of Croatian Immunological Society activities was published, in Croatian. This time, we have tried to include not only the founding and activities of Croatian Immunological Society but also all research groups working in the field of immunology in Croatia during the past 40 years. I wish to express my warmest thanks to all authors for their contributions. Especially for collecting all the relevant data, references and achievements of their research groups. From the collected data it is evident that Immunology in Croatia developed very fast (rapidly), and achieved a prominent place among scientific disciplines. Both national and international collaboration resulted in the establishment of new groups, not only at universities where immunology first started, but also at several institutes and hospitals in Zagreb and Rijeka. The number of Croatian Immunological Society members varies, being always more than one hundred and less than two hundred, but with a very good renewal rate of young members each year. We hope that, with improved financing policy of basic science in Croatia, more novices will be attracted, and that immunologists will remain as active as they were throughout this past 40 years, despite some quite untoward conditions. Sabina Rabatić guest edito

Digitale Infrastrukturen für die germanistische Forschung

Modern research in linguistics is increasingly reliant on digital infrastructure and information systems. This development began at the turn of the millennium and has since accelerated. The volume examines national and European infrastructure networks and the range of language resources in German linguistics that can be discovered, disclosed, and re-applied through digital infrastructure

CLARIN. The infrastructure for language resources

CLARIN, the "Common Language Resources and Technology Infrastructure", has established itself as a major player in the field of research infrastructures for the humanities. This volume provides a comprehensive overview of the organization, its members, its goals and its functioning, as well as of the tools and resources hosted by the infrastructure. The many contributors representing various fields, from computer science to law to psychology, analyse a wide range of topics, such as the technology behind the CLARIN infrastructure, the use of CLARIN resources in diverse research projects, the achievements of selected national CLARIN consortia, and the challenges that CLARIN has faced and will face in the future. The book will be published in 2022, 10 years after the establishment of CLARIN as a European Research Infrastructure Consortium by the European Commission (Decision 2012/136/EU)

CLARIN

The book provides a comprehensive overview of the Common Language Resources and Technology Infrastructure – CLARIN – for the humanities. It covers a broad range of CLARIN language resources and services, its underlying technological infrastructure, the achievements of national consortia, and challenges that CLARIN will tackle in the future. The book is published 10 years after establishing CLARIN as an Europ. Research Infrastructure Consortium