In vivo imaging of the early embryonic cortex in rodents

Abstract

Embryonic brain development is a highly dynamic period in human life. Any disturbances at this stage can cause life-long negative consequences, such as developmentally related diseases, including autism, schizophrenia, and bipolar spectrum disorders. During development the mother-embryo interface plays a crucial role in supplementing the growing organism with oxygen and nutrients, regulating chemical cues, and protecting it from infections and potentially hazardous compounds. However, most of the studies of embryonic brain development have utilized ex vivo systems such as slices and neuronal cultures. Despite the great value of the data obtained from ex vivo studies, they usually completely ignore the significance of the mother-embryo interaction. Thus, there is desperate need for novel preclinical models of embryonic development. In this thesis, we developed a novel technique for in vivo two-photon imaging in mouse embryos connected to the mother via umbilical cord. We developed the special chamber with polymer membrane allowing to keep embryos separately in the heated physiological solution while the umbilical connection to the anesthetized mother is preserved. We developed the protocol for stimulation of calcium activity using high-power laser radiation and studied the propagation of the resulting calcium waves in the mouse embryonic cortex in vivo under ketamine/xylazine anesthesia. We confirm the enhancing effect of caffeine on the evoked activity and the suppressing effect of the adenosine triphosphate (ATP) -receptor blockade, known from previous ex vivo studies. We analyzed the patterns of wave propagation and show the non-uniform spreading, which suggests the presence of differing connectivity patterns in the cortex already during the early stage of development. Further, we studied spontaneous calcium activity and cellular motility in the mouse embryonic cortex in vivo under light isoflurane anesthesia. We demonstrate two various patterns of ongoing activity: sporadic activation of single cells and correlated activity in the form of calcium waves. We show that blockade of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors with ketamine inhibits the calcium activity in vivo, corresponding with the arrest of cellular motility. In the last part of the thesis, we studied the dynamics of the externally introduced substance to the mouse embryonic brains in vivo. We used porous silicon nanoparticles, which are a promising drug delivery platform, as they can be loaded with poorly water-soluble drugs. We show that the nanoparticles can breach the placental barrier and accumulate in the brains of the embryo. To study the dynamics of nanoparticles when already in the cortex, we injected the embryonic brains intraventricularly. Nanoparticles, including ones 3-4 um in size, were distributed in 80% of the cortex already 4 hours following the injection, thus demonstrating high motility in the brain tissue of embryos. We confirmed the motility of nanoparticles in real time using the in vivo two-photon imaging of embryos connected to the mother under ketamine/xylazine anesthesia. The results emphasize the susceptibility of the embryonic cortex at the early stage of development to external particles, which should be taken into account in nanomedicine development. In summary, the developed in vivo imaging technique allowed functional studies in the embryonic cortex in real time. This will allow preclinical pharmacological investigations of the compounds while maintaining the physiological mother-embryo interface.Sikiöiden aivojen kehittyminen on erittäin dynaaminen vaihe ihmiselämässä. Mikä tahansa häiriö tässä vaiheessa voi aiheuttaa elinikäisiä negatiivisia seurauksia, kuten kehitykseen liittyviä sairauksia, sisältäen autismin, skitsofrenian ja bipolaarihäiriöt. Kehityksen aikana äidin ja sikiön välisellä liitynnällä on kriittinen rooli hapen ja ravintoaineiden välittämisessä kasvavalle organismille, kemikaalien säännöstelyssä ja infektioilta ja mahdollisesti haitallisilta aineilta suojaamisessa. Kuitenkin suurin osa sikiön aivojen kehityksen tutkimuksista ovat hyödyntäneet ex vivo systeemejä, kuten leikkeitä ja neuronien kulttureita. Huolimatta ex vivo tutkimuksella kerätyn datan suuresta arvosta ne yleensä jättävät kokonaan huomiotta äidin ja sikiön välisen vuorovaikutuksen merkityksen. Täten uusille prekliinisille sikiön kehityksen malleille on välttämätön tarve. Tässä väitöskirjassa kehitettimme uusi tekniikka in vivo tuplafotonikuvantamiselle hiirisikiöissä, jotka ovat yhteydessä äitiin napanuoran kautta. Kehitimme erityisen polymeerikalvokammion, joka mahdollistaa sikiöiden pitämisen erillään lämmitetyssä fysiologisessa solutionissa sillä välin kun napanuorayhteys nukutettuun äitiin säilyyn. Kehitimme protokollan kalsiumaktiviteetin stimuloimiseen käyttäen suurteholaserin säteilyä ja tutkimme syntyvien kalsiumaaltojen etenemistä hiiren aivokuoressa in vivo ketamiini/xylasiini anestesiassa. Me vahvistamme kofeiinin edistävän vaikutuksen synnytettyyn aktiviteettiin, ja adenosiini trifosfaatti (ATP) reseptorin sulun heikentävän vaikutuksen, mitkä ovat tunnettuja aiemmista ex vivo tutkimuksista. Analysoimme aallon etenemistapoja ja näytämme epäyhtenäisen leviämisen, mikä viittaa siihen, että aivokuoressa on erilaistuneet yhteydet jo kehityksen aikaisessa vaiheessa. Lisäksi tutkimme spontaania kalsiumaktiviteettia ja solujen liikettä hiirisikiön aivokuoressa in vivo kevyen isofluraani anestesian alaisuudessa. Näytämme kaksi erilaista kaavaa olemassa olevassa aktiviteetissa: yksittäisten solujen saatunnainen aktiviteetti ja kalsiumaaltojen muodossa oleva korreloitunut aktiviteetti. Me näytämme, että N-metyyli-D-aspartaatin (NMDA) estoreseptorit yhdessä ketamiinin kanssa estää kalsiumaktiviteetin in vivo, mikä vastaa estoa soluliikkuvuudessa. Väitöskirjan viimeisessä osassa tutkimme ulkoisesti tuodun aineen dynamiikka hiirisikiöiden aivoissa in vivo. Käytimme huokoista silikonia, joka on lupaava lääkettä luovuttava alusta, sillä niihin voi kuormata lääkeitä, jotka liukenevat huonosti veteen. Näytämme että nanopartikkelit voivat mennä istukkaesteen läpi ja kerääntyä sikiöiden aivoihin. Tutkiaksemme nanopartikkelien dynamiikkaa aivokuoressa, me injektoimme sikiöiden aivoja intraventrikulaarisesti. Nanopartikkelit,sisältäen 3-4 um kokoisia partikkeleita, olivat hajautuneet 80 prosenttiin aivokuoresta jo neljä tuntia injektoinnn jälken, mikä demonstroi korkeaa nanopartikkeleiden liikkuvuutta sikiöiden aivoissa. Vahvistimme nanopartikkeleiden liikkuvuuden reaaliajassa in vivo tupla-fotonikuvantamisella sikiöillä, jotka ovat yhdistetty äiteihin ketamiini/ksylatsiini anestesiassa. Tulokset korostavat sikiön aivokuoren alttiutta ulkoisille hiukkasille, mikä tulisi ottaa huomioon nanolääkkeitä kehitettäessä. Yhteenvetona, kehitetty in vivo kuvaantamisen malli sallii toiminnallisten tutkimusten teon sikiöiden aivokuoressa reaaliajassa. Tämä mahdollistaa yhdisteiden prekliinisen farmakologisen tutkimisen samalla kun fysiologinen äiti-sikiö yhtymäkohta säilyy