Metabolism of polyunsaturated fatty acids in human bone marrow derived mesenchymal stromal cells

Abstract

The application of human bone marrow derived mesenchymal stromal cells (hBMSCs) for regenerative or immunomodulatory therapies, e.g. treatment of the graft-versus-host disease, requires in vitro expansion of the cells. The hBMSCs undergo subtle changes during expansion which may compromise their functionality. In order to evaluate these changes lipidomics techniques were applied and the fatty acid (FA) and glycerophospholipid (GPL) profiles of hBMSCs were determined. During the cell passaging, arachidonic acid (20:4n-6) -containing species of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidyl-ethanolamine (PE) accumulated while the species containing monounsaturated fatty acids (MUFA) or n-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) decreased. The accumulation of 20:4n-6 and deficiency of n-3 PUFAs correlated with the decreased immunosuppressive capacity of the hBMSCs, which suggests that extensive expansion of hBMSCs harmfully modulates membrane GPLs profiles, affects lipid signaling and eventually impairs the functionality of the cells. Experiments, in which hBMSCs were cultured with different PUFA supplements revealed that the cells may limit the proinflammatory 20:4n-6 signaling by elongating this precursor with high biological activity to the less active precursor, 22:4n-6. It was also found that the ability of hBMSCs to produce long chain highly unsaturated fatty acids from C18 PUFA precursors was limited apparently due to the low desaturase activity of the cells. Thus, when the n-3 PUFA precursor, 18:3n-3, had little potency to reduce the GPL 20:4n-6 content, the eicosapentaenoic (20:5n-3) and docosahexaenoic (22:6n-3) acid supplements efficiently displaced the 20:4n-6 acyls, allowing attenuation of inflammatory signaling. These findings call for specifically designed optimal PUFA supplements for the cultures with sufficiently 20:5n-3 and 22:6n-3 but moderately 20:4n-6. Studies on the dynamics of PUFA incorporation into the major GPL classes revealed that the PUFAs in PC are remodeled at first, then those of the PEs and phosphatidylserines (PS). These results demonstrate that not only the type of PUFA administered but also the treatment time largely determines the resulting composition of the membrane GPL species, which serve as PUFA donors for the synthesis of lipid mediators. This thesis work highlights the importance of using lipidomics data to complement genomics or proteomics approaches when aiming at understanding of the therapeutic mechanisms of stem/stromal cells. The work provides tools to develop the protocols of hBMSCs culture and manipulate the functionality of the cells.Ihmisen luuydinperäisten mesenkymaalisten stroomasolujen (Human Bone Marrow Derived Stem Cells, hBMSC) käyttö regenerointi- ja immunomodulointiterapiamenetelmissä, kuten käänteishyljintäsairauden hoidossa, edellyttää solujen in vitro -viljelyä. Kasvatuksen myötä soluissa tapahtuu pieniä, niiden toiminnallisuutta vaarantavia muutoksia. Jotta muutoksia voitaisiin arvioida, solujen rasvahappo- ja glyserofsosfolipidiprofiilit määritettiin lipidomiikkamenetelmiä soveltaen. Solujen lisäysjakojen myötä arakidonihappoa (20:4n-6) sisältävät fosfatidyylikoliini- (phosphatidylcholine, PC) ja fostaftidyylietanoliaminiinilajit (phosphatidylethanolamine, PE) lisääntyivät, ja monoeeneja sisältävät lajit sekä n-3-ryhmään kuuluvat monityydyttymättömät rasvahapot (polyunsaturated fatty acid, PUFA) vastaavasti laskivat. Havaittu arakidonihapon nousu ja n-3-ryhmän monoeenien lasku korreloivat hBMSC-solujen vähentyneen immunosuppressivisen kyvyn kanssa. Tämä viittaa siihen, että toistuvat lisäysjaot muuttavat solujen glyserofosfolipidiprofiileja haitalliseen suuntaan ja vaikuttavat lipidisignalointiin lopulta heikentäen solujen toiminnallisuutta. Kokeissa, joissa soluja viljeltiin erilaisissa PUFA-täydennetyissä kasvatusliuoksissa, havaittiin, että solut saattavat rajoittaa 20:4n-6­välitteistä proinflammatorista signalointia muokkaamalla tätä prekursoria pidemmäksi ja vähemmän bioaktiiviseksi 22:4n-6-prekursoriksi. Kokeissa havaittiin myös, että solujen kyky tuottaa hyvin pitkiä monityydyttymättömiä rasvahappoja 18-hiilisistä rasvahapoista oli rajoittunutta todennäköisesti alhaisen solujen desaturaasiaktiivisuuden johdosta. Täten havaittiin että 18:3n-3-rasvahappo, joka on n-3-ryhmään kuuluva PUFA-prekursori, ei kyennyt juurikaan vähentämään glyserofosfolipidien arakidonihapposisältöä, kun taas eikosapentaeenihappo (20:5n-3) ja dokosahekaseenihappo (22:6n-3) korvasivat tehokkaasti kalvolipideissä olevan arakidonihapon, mahdollistaen inflammatorisen signaloinnin vaimentumisen. Löydökset peräänkuuluttavat solukasvatukseen erityisesti suunniteltujen rasvahappolisien kehitystä. Kasvatusliuoksen tulisi sisältää riittäviä määriä 20:5n-3- ja 22:6n-3-rasvahappoja, mutta vain maltillinen määrä 20:4n-6-rasvahappoa. Aiemmat tutkimukset monityydyttymättömien rasvahappojen liittämisestä merkittävimpiin glyserofosfolipidiluokkiin ovat osoittaneet, että PC-luokan monityydyttymättömät rasvahapot muokataan ennen PE- ja PS-luokkien monityydyttömättömiä rasvahappoja. Näin ollen rasvahappolisäyksen tyypin lisäksi myös käsittelyaika vaikuttaa pitkälti kalvojen rakennelipidien koostumukseen. Rakennelipidien asyyliketjut toimivat puolestaan luovuttajina, kun lipidisignaloinnissa toimivia monityydyttymättömiä rasvahappoja syntetisoidaan. Tämä väitöskirjatyö korostaa lipidomiikkatekniikoiden käytön tärkeyttä genomiikan ja proteomiikan ohella, kun pyritään selvittämään kanta- ja stroomasolujen terapeuttisia mekanismeja. Työn tulokset tarjoavat välineitä soluviljelymenetelmien kehittämiseen ja solujen toiminnallisuuden muokkaamiseen