Structural studies of potential new-generation antibiotic targets and the use of one of them, TonB as a model protein in protein engineering

Abstract

At the present time resistance to every main class of antibiotic has been observed. Therefore, the continuous development of new-generation antibiotics is crucial to combat the rise of antibiotic resistant strains. Identification of potential antibiotic targets and investigation of their structure and function represent a rational approach to developing a better understanding of the essential processes in which they are involved, and may lead to finding a mechanism to inhibit these processes. The first part of this thesis covers structural characterization and functional studies of the potential antibiotic targets TonB protein and the cell shape determining protein MreC. TonB is needed for TonB-dependent uptake of scarce nutrients, such as iron and vitamin B 12. The cell shape determining protein MreC is involved in cell wall synthesis, which is the target of penicillin and its derivatives. In this study, the three dimensional structures of the C-terminal domain of Helicobacter pylori TonB of different lengths and the C-terminal domain of Bacillus subtilis MreC were determined using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Additionally, interaction studies of MreC with penicillin-binding proteins were done using NMR spectroscopy and a bacterial two-hybrid system. NMR spectroscopy is a versatile tool to investigate protein structure, dynamics and interactions. One of the advantages of NMR is that proteins can be studied in solution under nearly physiological conditions. However, with increasing molecular size (> 25 – 30 kDa), structural investigation by NMR becomes more complex and often requires specific labelling techniques and alternative methodologies for NMR measurements. Segmental isotopic labelling, where only a part of the protein is stable isotopic labelled, is an attractive method to overcome the challenges of studying large proteins by NMR. Segmental isotopic labelling allows, e.g. investigation of individual protein domains in a full-length context. Furthermore, NMR is a powerful tool to study the integrity of a protein. Certain requirements, however, have to be fulfilled: the protein has to be soluble at high concentrations and stable over the whole measurement time. Therefore it is important to optimize protein production in order to obtain soluble, properly folded proteins at high concentrations. In the second part of this study, TonB has been used as a model protein to show traceless intein-mediated segmental isotopic labelling by salt induced protein trans splicing using a halophilic intein. This approach facilitates structural investigations of TonB by NMR. TonB consists of a well-structured C-terminal domain and a flexible proline-rich region, which would severely interfere with spectral quality in a uniformly labelled sample. Furthermore TonB was used as a model protein to show the benefit in protein expression of using tandem SUMO fusion vectors as tools for the expression of more soluble proteins, which tend to be expressed in an insoluble form. Both of these applications are beneficial for structural investigation of proteins by NMR and can be applied to other proteins.Kaikille antibiooteille resistenttien mikrobikantojen yleistyminen on maailmanlaajuinen terveysuhka. Tällaisten multiresistenttien kantojen hoitamiseksi tarvitaan uusia antibiootteja, joiden vaikutus perustuu uusiin kohdemolekyyleihin tai –rakenteisiin bakteerien pinnoilla. Uusien molekyylien rakenteellinen ja toiminnallinen tutkimus on tärkeää selvitettäessä niiden soveltuvuutta antibioottien kohdemolekyyleiksi. Tämän väitöskirjatyön ensimmäisessä osassa on tutkittu mahdollista antibioottien kohdeproteiinia TonB:tä sekä solun muotoa säätelevää proteiinia MreC:tä. Bakteereilla TonB-proteiini osallistuu eräiden bakteereille niukasti saatavilla olevien ravintoaineiden, kuten raudan ja B 12–vitamiinin, ottamiseen ympäristöstä. MreC toimii soluseinän synteesissä, ja soluseinässä ovat mm. penisilliinin ja sen johdannaisten kohderakenteet. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ydinmagneettisen resonanssispektroskopian eli NMR-spektroskopian avulla Helicobacter pylori-bakteerin TonB-proteiinin erimittaisten C-terminaalisten osien sekä Bacillus subtilis-bakteerin MreC-proteiinin kolmiulotteinen rakenne. Tämän lisäksi tutkittiin MreC-proteiinin ja penisilliiniä sitovien proteiinien vuorovaikutusta käyttäen NMR-spektroskopiaa sekä bakteerin kaksihybridi-menetelmää. NMR-spektroskopia on monipuolinen menetelmä, jonka avulla tutkitaan proteiinien rakennetta, dynamiikkaa ja vuorovaikutuksia esimerkiksi toisten proteiinien kanssa. Menetelmän merkittävä etu on se, että proteiineja voidaan tutkia liuostilassa fysiologisen kaltaisissa olosuhteissa. Haittapuolena menetelmässä on, että molekyylin koon kasvaessa (> 25 – 30 kDa) NMR:n käyttö on haasteellisempaa ja vaatii usein erityisiä leimausmenetelmiä. Osittainen isotooppinen leimaaminen, jossa vain osa proteiinista leimataan pysyvästi, voi auttaa suurten proteiinien NMR-mittauksissa. Tutkimuksen toisessa osassa TonB–proteiinia on käytetty mallina tutkittaessa suolasta riippuvaisen inteiinin soveltuvuutta osittaiseen isotooppiseen leimaamiseen. Suolan läsnäollessa halofiilinen inteiini tekee ns. trans splicing reaktion ja yhdistää kaksi proteiinidomeenia. Osittainen isotooppinen leimaus mahdollistaa esimerkiksi yksittäisten domeenien tutkimisen monidomeenisessa proteiinissa. TonB-proteiinissa on rakenteellinen C-terminaalinen domeeni sekä joustava proliinirikas alue, joka vaikuttaisi haitallisesti NMR-spektrien laatuun täysin leimatussa näytteessä. Sen lisäksi TonB-proteiinia on käytetty mallina tutkittaessa tandem SUMO-fuusiovektoreita, joiden avulla saatiin yleensä liukenemattomana tuottuvasta proteiinista liukoinen. NMR-tutkimusta varten proteiinien on pysyttävä liukoisina korkeissa pitoisuuksissa. Tämän vuoksi on tärkeä optimoida proteiinin tuotto siten, että saadaan liukoinen, oikeassa kolmiulotteisessa muodossa oleva proteiini, jonka pitoisuus on riittävän korkea. Molempia optimoituja menetelmiä voidaan käyttää myös muiden proteiinien tuottamiseen ja leimaamiseen, mikä edesauttaa proteiinien rakennetutkimuksia NMR-spektroskopian avulla