Development of anti-Fn14 antibody variants with intrinsic, FcγR-independent agonism

Fn14 ist als Mitglied der TNFRSF im Kontext proinflammatorischer Prozesse und demzufolge auch an Tumorentstehung und -wachstum beteiligt. Aufgrund der Hochregulation von Fn14 und seinem bislang einzig bekannten Liganden „TWEAK“ in Tumorzellen und ihrer Umgebung gilt dieses System für die immunonkologische Forschung als vielversprechend. Durch Fn14 können unter anderem der alternative und klassische NFκB-Signalweg aktiviert werden. Die Signalkaskade des klassischen NFκB-Signalwegs beruht auf der E3-Ligasefunktion rekrutierter cIAP1/2-Moleküle und erfordert daher eine Clusterbildung von zwei oder mehr TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2-Komplexen. Diese Aggregation kann im Vergleich zu löslichem TWEAK effektiv lediglich durch membrangebundenes TWEAK hervorgerufen werden. Im Rahmen der Entwicklung TWEAK/Fn14-basierter Wirkstoffe geht die Tendenz aktuell hin zur Herstellung TWEAK-unabhängiger, rekombinanter anti-Fn14-Antikörper mit intrinsischer Aktivität, Fn14-assoziierte Signalwege zu stimulieren. Ziel dieser Arbeit war es anti-Fn14-Antikörper mit einem effektiven, intrinsischen, FcγR-unabhängigen Agonismus zu produzieren. Die bereits etablierten, bisher lediglich schwach agonistisch wirksamen anti-Fn14-Antikörper 18D1, PDL192 und P4A8 vom Typ IgG1 wurden dazu im Vorfeld dieser Arbeit institutsintern durch gentechnische Fusion mit scFv jeweils als monospezifische bi-, tetra- und hexavalente Antikörperkonstrukte konzipiert. Durch die zusätzlichen Antigenbindungsstellen wurden die oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten ohne Applikation zusätzlicher Reagenzien oligomerisiert. Um potenzielle Fcγ-Rezeptor-vermittelte Interaktionen zu minimieren, wurde außerdem in jedes Antikörperkonstrukt die Punktmutation N297A eingefügt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die entstandenen neun Antikörpervarianten mittels transienter Transfektion in HEK293 Zellen produziert und deren Wirkung in verschiedenen molekularbiologischen Assays untersucht. Bei allen drei bivalenten Varianten konnte höchstens ein schwacher agonistischer Effekt an Fn14 verzeichnet werden. Alle oligovalenten anti-Fn14-Antikörpervarianten hingegen induzierten in HT1080 Zellen nachweislich den alternativen NFκB-Signalweg und verstärkten außerdem den TNF-TNFR1-vermittelten Zelltod in HeLa-RIPK3-FADD-KO Zellen. Eine effektive Aktivierung des klassischen NFκB-Signalwegs gelang jedoch lediglich durch die oligovalenten Varianten von 18D1 und PDL192. Durch diese wurde eine Wirkstärke vergleichbar der von membrangebundenem TWEAK erreicht, weshalb von einem FcγR-unabhängigen, intrinsischen Agonismus dieser anti-Fn14-Antikörpervarianten ausgegangen werden kann. Hinsichtlich Expressionsniveau und Stabilität unterschieden sich die produzierten anti-Fn14-Antikörper deutlich, weswegen vor allem die tetravalenten Varianten von 18D1 und PDL192 für weitere Untersuchungen und eine potenzielle klinische Anwendung infrage kommen.As a member of the TNFRSF family Fn14 is involved in proinflammatory processes, and consequently, also in tumor formation and growth. Due to the upregulation of Fn14 and its only known ligand "TWEAK" in tumor cells and their environment, this system is considered promising in immuno-oncology research. Fn14 can activate both the alternative and classical NFκB signaling pathway. The signaling cascade of the classical NFκB pathway relies on the E3 ligase function of recruited cIAP1/2 molecules and, therefore, requires the formation of clusters of two or more TWEAK3-Fn143-TRAF23-cIAP1/2 complexes. This aggregation can be effectively induced only by membrane-bound TWEAK in comparison to soluble TWEAK. In the development of TWEAK/Fn14-based therapeutics, the current trend is moving towards the production of TWEAK-independent recombinant anti-Fn14 antibodies with intrinsic activity to stimulate Fn14-associated signaling pathways. The goal of this work was to produce anti-Fn14 antibodies with efficient, intrinsic, FcγR-independent agonism. The previously established, weakly agonistic anti-Fn14 antibodies, 18D1, PDL192, and P4A8 of the IgG1 type, were designed as monospecific bi-, tetra-, and hexavalent antibodies by genetically fusing them with scFv in advance of this work. The additional antigen-binding sites allowed the oligovalent anti-Fn14 antibody constructs to be oligomerized without the application of additional reagents. To minimize potential Fcγ receptor-mediated interactions, the N297A point mutation was also introduced into each antibody construct. In the context of this work, the resulting nine antibody variants were produced through transient transfection in HEK293 cells, and their effects were examined in various molecular biology assays. In all three bivalent variants, at most, a weak agonistic effect on Fn14 was observed. However, all oligovalent anti-Fn14 antibody variants demonstrably induced the alternative NFκB signaling pathway in HT1080 cells and also enhanced TNF-TNFR1-mediated cell death in HeLa-RIPK3-FADD-KO cells. Efficient activation of the classical NFκB signaling pathway was achieved only by the oligovalent variants of 18D1 and PDL192. These variants reached a potency comparable to that of membrane-bound TWEAK, suggesting an FcγR-independent, intrinsic agonism of these anti-Fn14 antibody variants. The produced anti-Fn14 antibodies differed significantly in terms of expression levels and stability, making the tetravalent variants of 18D1 and PDL192 particularly suitable for further investigations and potential clinical applications

Fragmentorbitalbasierte Konfigurationswechselwirkungs-Methode zur Beschreibung korrelierter Zustände in ausgedehnten molekularen Aggregaten

This thesis explores the theoretical and computational study of singlet fission in perylene diimide (PDI), perylene, and B-N-substituted perylene aggregates, with a focus on understanding and optimizing electronic interactions and pathways. Beginning with an introduction to singlet fission and its theoretical foundations, the work employs advanced quantum mechanical methods, including active space decomposition, semi-empirical approaches, CASPT2, and TDDFT, to investigate diabatic couplings, singlet fission rates in dimers, and singlet and triplet exciton energies. Subsequent work includes the development of a configuration interaction methodology for analyzing diabatic Hamiltonian elements in polymer aggregates. This approach incorporates symbolic algebra to automate the generation of analytical expressions for matrix elements in ab initio configuration interaction calculations. Using second quantization and the Jordan-Wigner transformation, fermionic operators are represented as Kronecker products of Pauli matrices, implemented with SymPy. This facilitates the symbolic generation of spin-adapted Slater determinants and Hamiltonian matrix elements, enabling detailed fragment analysis and the simulation of electron transport in complex molecular systems. The resulting programs efficiently compute molecular properties. Further studies extend the application of this model to the analysis of PDI trimers, providing a deeper understanding of electronic structures and improved singlet fission efficiency. The research introduces novel mechanisms for singlet fission and addresses the limitations of dimer models by generalizing them to incorporate separated Charge Transfer (C...T) states, $^{1}(T...T)$ states, and mixed triplet-charge transfer states. Analytical expressions for diabatic matrix elements are derived, enhancing the understanding of constructively and destructively interfering singlet fission pathways and electronic couplings.Diese Arbeit befasst sich mit der theoretischen und rechnerischen Untersuchung der Singulett-Spaltung in Perylendiimid (PDI), Perylen und B-N-substituierten Perylen-Aggregaten, wobei der Schwerpunkt auf dem Verständnis und der Optimierung der elektronischen Wechselwirkungen und Wege liegt. Die Arbeit beginnt mit einer Einführung in die Singulett-Spaltung und ihre theoretischen Grundlagen und verwendet fortschrittliche quantenmechanische Methoden, einschließlich Aktivraum-Zerlegung, semi-empirische Ansätze, CASPT2 und TDDFT, um diabatische Kopplungen, Singulett-Spaltungsraten in Dimeren und Singulett- und Triplett-Exzitonen-Energien zu untersuchen. Die anschließende Arbeit umfasst die Entwicklung einer Konfigurationswechselwirkungsmethodik zur Analyse diabatischer Hamilton-Elemente in Polymeraggregaten. Dieser Ansatz beinhaltet symbolische Algebra, um die Generierung von analytischen Ausdrücken für Matrixelemente in ab initio Konfigurationswechselwirkungsberechnungen zu automatisieren. Unter Verwendung der zweiten Quantisierung und der Jordan-Wigner-Transformation werden fermionische Operatoren als Kronecker-Produkte von Pauli-Matrizen dargestellt und mit SymPy implementiert. Dies erleichtert die symbolische Generierung von spinadaptierten Slater-Determinanten und Hamilton-Matrixelementen und ermöglicht eine detaillierte Fragmentanalyse und die Simulation des Elektronentransports in komplexen molekularen Systemen. Die resultierenden Programme berechnen effizient molekulare Eigenschaften. In anschließenden Arbeiten wurde die Anwendung dieses Modells auf die Analyse von PDI-Trimeren ausgedehnt, was ein tieferes Verständnis der elektronischen Strukturen und eine verbesserte Effizienz der Singulett-Spaltung ermöglicht. Die Forschungsarbeit stellt neue Mechanismen für die Singulett-Spaltung vor und geht auf die Einschränkungen von Dimer-Modellen ein, indem sie diese verallgemeinert, um getrennte Ladungstransfer-Zustände (C...T), $^{1}(T...T)$ Zustände und gemischte Triplett-Ladungstransfer-Zustände einzubeziehen. Es werden analytische Ausdrücke für diabatische Matrixelemente abgeleitet, die das Verständnis von konstruktiv und destruktiv interferierenden Singulett-Spaltungspfaden und elektronischen Kopplungen verbessern

Characterization of thymus tissue from healthy children and children with Down syndrome at the cellular level

Kinder mit Down Syndrom weisen Zeichen der vorzeitigen Immunoseneszenz auf. Der genaue Mechanismus dahinter und das Stadium der T-Zell-Reifung, in welchem der Defekt vorliegt, sind jedoch noch nicht genau verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Vergleich hinsichtlich der Zusammensetzung der Thymozyten von Kindern mit DS und gesunden Kindern und wichtige Unterschiede vor allem hinsichtlich einer vorzeitigen T-zellulären Immunoseneszenz angestellt. Es wurde das Thymusgewebe von 23 Kindern mit/ohne DS mittels PCR und Immunhistochemie untersucht. Im Thymus war das Verhältnis von CD45RA/CD45RO bei DS zugunsten von CD45RO verschoben, was auf einen Defekt in der Thymopoese hinweist und die vielfach beschriebene geringere Freisetzung von naiven CD45RA+ T-Zellen aus dem Thymus erklären könnte. Das Immunsystem von Kindern mit DS weist mit der geringeren Expression von CD45RA bei gleichzeitig verstärkter Expression von CD45RO Zeichen der vorzeitigen Immunoseneszenz auf. Allerdings ist dieses Merkmal möglicherweise Folge des Defekts in der Thymopoese (im Umlagerungsprozess von CD45RO zu CD45RA), der hier gezeigt werden konnte. Klinische Forschung zu Immuntherapien für Personen mit DS, die aufgrund ihres Immunphänotyps an schweren Immundefiziten leiden, ist notwendig. Es könnte jedoch sein, dass die bisher verfügbaren Immuntherapien bei DS nicht effektiv wären, da wahrscheinlich ein Defekt in der Thymopoese vorliegt. Allerdings könnten neue Medikamente zukünftig die Versorgung von Kindern mit DS verbessern und die infektionsbedingte Mortalität vermindern.The immune phenotype of children with Down Syndrome has been shown to have similarities to a senescent immune systeme. The exact cause and mechanisms leading to these alterations in DS are still not clear. To further investigate in this topic and extend the knowledge, we examined the thymic tissue of children with DS and healthy controls. The study included 23 children with or without DS, who had undergone heart surgery within the first months to years of life. We examined the transcription factors, cell surface markers and cytokine profile in the thymic tissue with PCR analysis and immunohistochemistry. We found a different CD45RA/CD45RO ratio within the thymic tissue in immunohistochemistry. Children with DS seemed to express less CD45RA, but more CD45RO in the thymic tissue. This leads us to the conclusion of a defect in thymopoesis in children with DS and may also explain the often described lower thymic output of naïve T-cells in DS. Our findings support the thesis of premature immunosenescence in DS as a low expression of CD45RA in T-cells together with a higher expression of CD45RO are signs of an aged immune system. We were able to show a defect in the thymopoesis in terms of an altered CD45RA/CD45RO ratio in the thymus of DS. Further research should investigate in novel strategies of immune therapy for individuals with DS who suffer from severe immunodeficiencies due to their immune phenotype. It is yet to be proven that the established immune therapies would actually be effective in DS as there probably is a defect in thymopoesis

Investigation of the adipogenic differentiation potential of ASCs on peptide-functionalized fiber constructs

In der vorliegenden Arbeit wurde die Vitalität, Integrität und Differenzierung von adipogenen Stammzellen (ASCs) auf biofunktionalisierten Faserkonstrukten unter Einsatz diverser biochemischer Methoden untersucht. Dabei stellen die Faserkonstrukte ein Gerüst (eng. scaffold) dar, worauf sich die Zellen anheften und vorzugsweise proliferieren können, um damit potenzielle lokale Schäden eines Organismus zu beheben. Dafür wurde das Fasergerüst mit drei verschiedenen Laminin-Peptidsequenzen funktionalisiert zur Steigerung der Zelladhäsion via Integrine und die Zellen schließlich in vitro zur Differenzierung angeregt. Nach qualitativer Auswertung der biofunktionalisierten Scaffolds ohne Zellen, wie auch Scaffolds mit Zellen ohne induzierten Differenzierungsreiz, schien die RGDS-Sequenz sowohl bezüglich der Makrostruktur der Fasern als auch der produzierten EZM-Fläche auf dem Gerüst die besten Resultate erzielt zu haben. Darüber hinaus wurden die höchsten Werte für den Zellmetabolismus anhand des WST-1 Assays und die höchsten relativen DNA-Mengen für RGDS festgestellt. Nach Zugabe der Differenzierungsinduktoren zur Untersuchung der Adhäsion für ASCs konnte qualitativ kein Unterschied anhand der Fluoreszenzmikroskopie zwischen den Peptidsequenzen oder Medienzusammensetzungen erkannt und interpretiert werden. Hingegen konnte mit Hilfe der qPCR von adipogenen Markergenen eine höhere Expressionsrate für PPARγ und PLIN1 auf RGDS-IKVAV- und RGDS-YISGR-Konstrukten im Vergleich zu RGDS-Konstrukten bestimmt werden. Diese Tatsache bekräftigt das Potential von IKVAV bzw. YIGSR als mögliche Adhäsions-Ankerpunkten für (Prä-)Adipozyten für ausgewählte Einsatzgebiete in der regenerativen Medizin. Basierend auf den vorliegenden Daten weist bisher RGD(S) dennoch das höchste Potential als nahezu universelle Zell-Adhäsionssequenz auf und bekräftigt erneut die umfassende Anzahl an Publikationen und das hohe Forschungsinteresse diese Sequenz zu integrieren, die weit über das Elektrospinning hinausgehen.In the present study, the vitality, integrity and differentiation of adipogenic stem cells (ASCs) on biofunctionalized fibrous constructs were investigated using various biochemical methods. The fiber constructs represent a scaffold on which the cells can attach and preferably proliferate in order to repair potential local damage to an organism. For this purpose, the fibre scaffold was functionalized with three different laminin peptide sequences to increase cell adhesion via integrins and the cells were finally stimulated to differentiate in vitro. After qualitative evaluation of the biofunctionalized scaffolds without cells, as well as scaffolds with cells without induced differentiation stimulus, the RGDS sequence appeared to have achieved the best results in terms of both the macrostructure of the fibers and the area of ECM produced on the scaffold. In addition, the highest values for cell metabolism using the WST-1 assay and the highest relative DNA amounts were found for RGDS. After addition of the differentiation inducers to study adhesion for ASCs, no qualitative difference could be detected and interpreted by fluorescence microscopy between the peptide sequences or media compositions. In contrast, qPCR of adipogenic marker genes revealed a higher expression level for PPAR “γ” and PLIN1 on RGDS-IKVAV and RGDS-YISGR constructs compared to RGDS constructs. This fact confirms the potential of IKVAV or YIGSR as possible adhesion anchor points for (pre-)adipocytes for selected applications in regenerative medicine. Based on the available data, RGD(S) still shows the highest potential as a nearly universal cell adhesion sequence and reaffirms the extensive number of publications and the high research interest in integrating this sequence, which goes far beyond electrospinning

Agency and equality in education: fundamental research in the context of education for people with emotional and behavioural disorders

Stellvertretung und insbesondere die Anwaltschaft sind oft genutzt Argumente für ein pädagogisches Handeln der Sonderpädagogik in Disziplin und Profession. Gegenüber einer solchen starken semantischen Präsenz steht eine große Lücke der fachwissenschaftlichen Fundierung der Begriffe und Konzepte rund um Stellvertretung. Der Blick in entsprechende Theorien der Referenz- und Nachbardisziplinen zeigt jedoch, dass Stellvertretung weit aus voraussetzungsreicher und reflexionsbedürftiger ist, als es der Diskurs in der Sonderpädagogik suggeriert (Röhr, 2002; Sofsky, 1994). So spielen Fragen der Mandatsvergabe, -kontrolle, -beendigung und auch -kontrolle eine große Rolle und erfahren eine erhöhte Komplexität im Modus der pädagogischen Stellvertretung. Diese Komplexität wiederum ist es, die vorrangig in der Praxis eine Orientierungshilfe für Entscheidungssituationen einfordert. Da sich solche Situationen primär in der Sphäre der Erziehung wiederfinden, bietet sich als ethische Rahmung die advokatorische Ethik nach Micha Brumlik (Brumlik, 2017) an. Mit ihren Grundsätzen der Bemündigung, Schmerzvermeidung, Antizipation von Zustimmung sowie Emanzipation und Verantwortung stellt sie eine wichtige Grundlage zur Abwägung pädagogischen Handelns dar. Die advokatorische Ethik erweist sich jedoch an entscheidender Stelle noch unterbestimmt: In ihrer Auffassung von Bildung, Gerechtigkeit und der Ausgestaltung der partikularen Nahbeziehung. Diese Lücken können mit Hilfe der Bildungsgerechtigkeit als Anerkennungsgerechtigkeit nach Krassimir Stojanov (2007) geschlossen werden. Darüber hinaus erweist sich diese Spielart der Bildungsgerechtigkeit als ebenso tragfähig, um gemeinsam mit der advokatorischen Ethik eine ethische Grundlegung sonderpädagogischen Handelns in Grenzsituationen zu fassen. Werden beide Konzepte zusammengeführt, bilden sie die Grundlage für eine Argumentation für einen idealen Förderort für Kinder und Jugendliche mit auffälligem Verhalten und Erleben. Diese Argumentation mündet in der Formulierung von anerkennungsgerechten Räumen, die stellvertretend geschaffen werden. Die vorliegende Arbeit leitet diese Argumentation ausführlich her und begründet sie im erzieherischen Verhältnis. Ausgehend von allgemeinen ethischen Fragestellungen der Sonderpädagogik, wird über die Skizzierung der Pädagogik bei Verhaltensstörungen und der Grundlegung von Stellvertretung die Basis für die Zusammenführung von advokatorischer Ethik und Anerkennungsgerechtigkeit gestaltet. Den Abschluss stellen Implikationen für den Diskurs in der Pädagogik bei Verhaltensstörungen in Disziplin und Profession dar. Die Arbeit leistet somit dreierlei: Die Problembeschreibung rund um den Begriff der Stellvertretung, eine erstmalige Bündelung der Argumentationen Stojanovs zur Anerkennungsgerechtigkeit sowie eine Aufbereitung der genannten Theorien und Konzepte für die Pädagogik bei Verhaltensstörungen und darüber hinaus.Agency and, in particular, advocacy are often used as arguments for pedagogical action in special education as a discipline and profession. In contrast to such a strong semantic presence, there is a significant gap in the scientific foundation of the terms and concepts surrounding advocacy and agency. However, a look at the corresponding theories of the reference disciplines shows that agency is far more presuppositional and in need of reflection than the discourse in special education suggests (Röhr, 2002; Sofsky, 1994). Issues such as the delegation, control, termination, and oversight of mandates play a significant role and exhibit increased complexity in the mode of educational representation. This complexity, in turn, primarily calls for guidance decision-making situations in practice. Since such situations are mainly found within the sphere of education, the advocacy ethics according to Micha Brumlik (Brumlik, 2017) offers an ethical framework. Advocatory ethics, however, proves to be underdetermined at a crucial point: In its conception of education (Bildung), justice and the design of particularized close relationships. These gaps can be addressed using the concept of educational justice as recognition justice according to Krassimir Stojanov (2007). Furthermore, this variant of educational justice proves to be equally capable of providing an ethical foundation for special education actions in boundary situations, when combined with advocacy ethics. When these two concepts are integrated, they form the basis for an argument for an ideal educational setting for children and adolescents with disruptive behavior and experiences. This argument culminates in the formulation of recognition- appropriate spaces that are created on behalf of them. This thesis develops this argument in detail and justifies it within the educational context. Starting from general ethical questions of special education, the basis for the combination of advocacy ethics and recognition justice is formed by outlining the pedagogy of behavioral disorders and the foundation of substitution and agency. The conclusion presents implications for the discourse in the pedagogy of behavioral disorders in both discipline and profession. The work thus accomplishes three things: a description of the problems surrounding the concept of agency, a first-time bundling of Stojanov's arguments on recognition justice, and the elaboration of the mentioned theories and concepts for the pedagogy of behavioral disorders and beyond

Vergleich der Mortalität perioperativer Lungenarterienembolien und Reanimationen in Krankenhäusern ohne und mit Vorhaltung von extrakorporaler Membranoxygenierung

Bei der Lungenarterienembolie handelt es sich um eine relativ seltene, aber potentiell lebensbedrohliche Komplikation chirurgischer Eingriffe. Durch diese sowie weitere perioperative Komplikationen kann es als gemeinsame fatale Endstrecke zu Reanimationssituationen kommen. In beiden Fällen ist eine zügige Therapieentscheidung und -einleitung von entscheidender Bedeutung. In den letzten Jahren hat sich die ECMO als Therapieoption bei kardiopulmonalen Störungen zunehmend etabliert, so zum Teil auch bei LAE und Reanimationen. Ziel dieser Arbeit ist es nachzuweisen, inwiefern Krankenhäuser mit Expertise in der ECMO-Anwendung einen Überlebensvorteil bei den genannten perioperativen Komplikationen bieten können. Die Häufigkeit des Auftretens korreliert dabei mit dem Alter, dem Geschlecht und Vorerkrankungen des Patienten, sowie der Invasivität des Eingriffs. Datengrundlage waren die vom Statistischen Bundesamt zur Verfügung gestellten DRG-Daten aller deutschen Krankenhäuser der Jahre 2012-2019. Im risikoadjustierten Vergleich der Odds-Ratios der Mortalität zwischen Krankenhäusern mit jährlich mindestens 20 ECMO-Anwendungen mit den übrigen Krankenhäusern zeigte sich eine deutlich niedrigere Mortalität in den ECMO-Zentren. Da der Anteil der Patienten, die tatsächlich ein extrakorporales Verfahren erhalten haben auch in den ECMO-Zentren relativ niedrig ist, und diese Patienten außerdem eine hohe Mortalität aufweisen, kann die ECMO-Anwendung an sich nicht die Ursache für die niedrige Mortalität sein. Die ECMO-Vorhaltung des Krankenhauses ist somit ein Surrogatparameter für eine hohe Expertise im Management akuter kardiopulmonaler Störungen. Dies deckt sich mit der Beobachtung in anderen Bereichen, dass eine hohe Anzahl durchgeführter Eingriffe im jeweiligen Krankenhaus mit einem besseren Ergebnis einhergeht. Eine Durchführung von großen chirurgischen Eingriffen in Zentren mit Erfahrung ist daher auch aufgrund des erfolgreicheren Komplikationsmanagements insbesondere für Risikopatienten und -eingriffe zu empfehlen.Pulmonary Embolism is a relatively rare but potentially life-threatening complication of surgical procedures. Due to this and other perioperative complications, there can be fatal outcomes leading to resuscitation situations. In both cases, a fast decision and initiation of therapy are of crucial importance. In recent years, ECMO (Extracorporeal Membrane Oxygenation) has increasingly become established as a treatment option for cardiopulmonary disorders, including cases of pulmonary embolism and resuscitations. The aim of this study is to show if hospitals with expertise in ECMO application can offer a survival advantage for patients with the mentioned perioperative complications. The frequency of occurrence correlates with the patient's age, gender, pre-existing conditions, and the invasiveness of the procedure. The data used for this study were the DRG (Diagnosis-Related Group) data from all German hospitals for the years 2012-2019, provided by the Federal Statistical Office. In the risk-adjusted comparison of the odds ratios for mortality between hospitals with at least 20 ECMO applications annually and other hospitals, a significantly lower mortality was found in ECMO centers. Since the percentage of patients actually receiving an extracorporeal procedure is relatively low even in ECMO centers, and these patients also have high mortality rates, ECMO application itself cannot be the cause of the lower mortality. Therefore, the availability of ECMO at the hospital serves as a surrogate marker for high expertise in managing acute cardiopulmonary disorders. This correlates with observations in other fields, where a high number of procedures performed at a hospital is associated with better outcomes. Performing major surgical procedures in centers with experience is therefore recommended, especially for high-risk patients and procedures, due to more successful complication management

Effects of Tumor Treating Fields on the Blood-Brain Barrier

Tumor Treating Fields (TTFields) sind eine neue Therapiemodalität bei Glioblastomen. Durch Zufall wurde beobachtet, dass TTFields morphologische Veränderungen in einem in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) aus mikrovaskulären Endothelzellen (cerebEND-Zellen) verursachten. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Effekte genauer zu erforschen. Beim Austesten der besten Behandlungsfrequenz war nicht die beim Glioblastom therapeutisch wirksame Frequenz von 200 kHz optimal. Die größten Effekte auf die BHS traten nach einer 72-stündigen Behandlung mit 100 kHz TTFields auf. Dabei veränderten die cerebEND-Zellen ihre typische lang gestreckte Spindelform und stellten sich nach der Therapie kurz und rundlich dar. Des Weiteren verlagerte sich das Tight Junction Protein Claudin-5 von der Zellmembran in das Zytoplasma. Die Gesamtkonzentration von Claudin-5 blieb dabei unverändert. Diese Effekte waren reversibel, sodass sich die cerebEND-Zellen nach Beendigung der TTFields-Therapie innerhalb von 96 h vollkommen erholten. Die Erholung der Zellen beruhte nicht auf einer Zellproliferation und eine TTFields-Behandlung verursachte keinen apoptotischen Zelltod. Das bedeutet, dass die Vitalität der cerebEND-Zellen durch die Therapie unbeeinflusst war. Weiterführende Arbeiten wiesen nach, dass die durch eine 100 kHz TTFields-Behandlung über 72 h verursachten morphologischen Veränderungen zu einer signifikant erhöhten Permeabilität der BHS für Moleküle bis zu einer Größe von 65 kDa führten. Der zugrunde liegende Mechanismus beruht wahrscheinlich auf der Phosphorylierung von Claudin-5 über den GEF-H1/Rho/ROCK Signalweg, wodurch Claudin-5 von der Zellmembran der cerebEND-Zellen in das Zytoplasma disloziert. Dies hat zur Folge, dass sich die interzellulären Kontakte lösen und sich die BHS öffnet. Diese Beobachtungen könnten die Grundlage für eine deutlich verbesserte Therapie von ZNS-Erkrankungen sein, da potenziell wirksame medikamentöse Therapeutika eingesetzt werden könnten, welche aktuell die BHS nicht überqueren können. Zugleich bieten TTFields eine im Vergleich zu anderen Methoden nebenwirkungsarme Möglichkeit, um die BHS gezielt und reversibel zu öffnen. In Zusammenschau der vorhandenen Daten aus verschiedenen präklinischen Versuchen wäre es denkbar, TTFields mit einer Frequenz von 100 kHz für erste klinische Studien einzusetzen.Tumor Treating Fields (TTFields) are a new therapeutic modality for glioblastoma. By chance, TTFields were observed to cause morphological changes in an in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) of microvascular endothelial cells (cerebEND-cells). The aim of this thesis was therefore to investigate these effects in more detail. When testing the best treatment frequency, the frequency of 200 kHz, which is therapeutically effective for glioblastoma, was not optimal. The greatest effects on the BBB occurred after 72 hours of treatment with 100 kHz TTFields. The cerebEND-cells changed their typical elongated spindle shape and appeared short and round after the therapy. Furthermore, the tight junction protein claudin-5 dislocated from the cell membrane to the cytoplasm. The total concentration of claudin-5 remained unchanged. These effects were reversible, so that the cerebEND-cells fully recovered within 96 hours after the end of TTFields therapy. Cell recovery was not based on cell proliferation, and TTFields treatment did not cause apoptotic cell death. This means that the vitality of the cerebEND-cells was unaffected by the therapy. Further work showed that the morphological changes caused by a 100 kHz TTFields treatment over 72 h, led to a significantly increased permeability of the BBB for molecules up to 65 kDa in size. The underlying mechanism is likely due to the phosphorylation of claudin-5 via the GEF-H1/Rho/ROCK signaling pathway, causing claudin-5 to dislocate from the cell membrane of cerebEND-cells into the cytoplasm. As a result, the intercellular contacts are loosened and the BBB opens. These observations could be the basis for a significantly improved therapy of CNS diseases, as potentially effective drug therapeutics could be used, which currently cannot cross the BBB. At the same time, TTFields offer a way to open the BBB in a targeted and reversible manner with few side effects compared to other methods. Combined with the available data from various preclinical trials, it would be conceivable to use TTFields with a frequency of 100 kHz for initial clinical trials

Does vitamin D deficiency predict tumour malignancy in patients with bone tumours? Data from a multi-center cohort analysis

Vitamin-D-Mangel ist ein globales Gesundheitsproblem, welches Schätzungen zufolge über eine Milliarde Menschen weltweit betrifft. Vitamin D hat vor allem die Funktion eines Regulators des Kalzium- und Phosphatstoffwechsels und ist somit für die richtige Knochenmineralisierung unverzichtbar. Darüber hinaus ist bekannt, dass Vitamin D zahlreiche extraskelettale Wirkungen hat. So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Vitamin D eine direkte antiproliferative, differenzierungsfördernde und apoptotische Effekte auf Krebszellen hat. Daher wurde Vitamin-D-Mangel mit einem erhöhten Krebsrisiko und einer schlechteren Prognose bei mehreren bösartigen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Erst kürzlich wurde nachgewiesen, dass Vitamin-D-Mangel das sekundäre Krebswachstum im Knochen fördert. Diese Erkenntnisse waren teilweise auf eine verstärkte Knochenumbildung zurückzuführen, aber auch auf die direkten Auswirkungen von Vitamin D auf Krebszellen. Da bis heute nur sehr wenig über den Vitamin-D-Status von Patienten mit Knochentumoren bekannt ist, bestand das Ziel dieser Studie darin, den Vitamin-D-Status von Patienten mit verschiedenen Knochentumoren zu beurteilen. Darüber hinaus sollte geklärt werden, ob bei Patienten mit Knochentumoren ein Zusammenhang zwischen dem Vitamin-D-Status vor der Diagnose und der Tumormalignität besteht. In einer multizentrischen Kohortenanalyse wurden die 25(OH)D-, Parathormon- und Kalziumwerte von 225 Patienten untersucht, die zwischen 2017 und 2018 an verschiedenen malignen und benignen Knochentumoren erkrankten. Insgesamt hatten 76 % aller Patienten einen verminderten Vitamin-D-Spiegel unter 30 ng/ml. mit einem mittleren 25(OH)D-Gesamtwert von 21,43 ng/ml (53,58 nmol/l). Bei 52 % (117/225) der Patienten wurde ein manifester Vitamin-D-Mangel festgestellt (<20 ng/ml) und bei weiteren 24 % (55/225) der Patienten ein insuffizienter Spiegel (20-29 ng/ml). Insbesondere hatten Patienten mit diagnostizierten bösartigen Knochentumoren signifikant niedrigere 25(OH)D-Werte als Patienten mit diagnostizierten gutartigen Knochentumoren [19,3 vs. 22,75 ng/ml (48,25 vs. 56,86 nmol/l); p = 0,04). Zusammenfassend stellten wir fest, dass bei Patienten mit Knochentumoren ein weit verbreiteter und beunruhigender Vitamin-D-Mangel bzw. eine Vitamin-D-Insuffizienz vorliegt. Allerdings scheinen gerade für Patienten mit Knochentumoren ausreichende Vitamin-D-Werte von großer Bedeutung zu sein. Daher glauben wir, dass der 25(OH)D-Status bei diesen Patienten routinemäßig überwacht werden sollte. Insgesamt sollte das Bewusstsein der Ärzte geschärft werden, den Vitamin-D-Status von Patienten mit Knochentumoren oder von Patienten mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von Knochentumoren zu beurteilen und gegebenenfalls zu korrigieren.Vitamin D deficiency is a global health concern that is estimated to afflict over one billion people globally. The major role of vitamin D is that of a regulator of calcium and phosphate metabolism, thus, being essential for proper bone mineralisation. Concomitantly, vitamin D is known to exert numerous extra-skeletal actions. For example, it has become evident that vitamin D has direct anti-proliferative, pro-differentiation and pro-apoptotic actions on cancer cells. Hence, vitamin D deficiency has been associated with increased cancer risk and worse prognosis in several malignancies. We have recently demonstrated that vitamin D deficiency promotes secondary cancer growth in bone. These findings were partly attributable to an increase in bone remodelling but also through direct effects of vitamin D on cancer cells. To date, very little is known about vitamin D status of patients with bone tumours in general. Thus, the objective of this study was to assess vitamin D status of patients with diverse bone tumours. Moreover, the aim was to elucidate whether or not there is an association between pre-diagnostic vitamin D status and tumour malignancy in patients with bone tumours. In a multi-center analysis, 25(OH)D, PTH and calcium levels of 225 patients that presented with various bone tumours between 2017 and 2018 were assessed. Collectively, 76% of all patients had insufficient vitamin D levels with a total mean 25(OH)D level of 21.43 ng/ml (53.58 nmol/L). In particular, 52% (117/225) of patients were identified as vitamin D deficient and further 24% of patients (55/225) were vitamin D insufficient. Notably, patients diagnosed with malignant bone tumours had significantly lower 25(OH)D levels than patients diagnosed with benign bone tumours [19.3 vs. 22.75 ng/ml (48.25 vs. 56.86 nmol/L); p = 0.04). In conclusion, we found a widespread and distressing rate of vitamin D deficiency and insufficiency in patients with bone tumours. However, especially for patients with bone tumours sufficient vitamin D levels seem to be of great importance. Thus, we believe that 25(OH)D status should routinely be monitored in these patients. Collectively, there should be an increased awareness for physicians to assess and if necessary correct vitamin D status of patients with bone tumours in general or of those at great risk of developing bone tumours

Charakterisierung neuer Ansätze zur pharmakologischen Modulation der Thrombozytenrezeptoren GPVI und CLEC-2 in humanisierten Mausmodellen

Antiplatelet therapy plays an important role in reducing or preventing (the risk of) thrombotic events, thus increasing life quality and expectancy of patients with a heart or brain infarction. Nowadays, the gold standard for such patients is the use of aspirin and P2Y12 receptor inhibitors, targeting platelet activation processes dependent on thromboxane A2 and ADP, respectively, both of which are important second mediators of platelet activation. However, treatment with dual antiplatelet drugs coincides with an increased risk of bleeding events. In this thesis, my hypothesis is that the targeted modulation in platelets of ligand-induced clustering of the collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) or the podoplanin receptor (C-type lectin-like receptor 2, CLEC-2) provides anti-thrombotic protection with minimal effect on normal hemostasis. To address this, I have characterized the thrombosis and hemostasis profiles of CRISPR-Cas9-modified mice with platelets expressing the human form of GPVI or CLEC-2 receptors, using both in vitro and in vivo methods. In addition, I have used these mouse models to validate novel inhibitors directed against human GPVI or CLEC-2. Chapter 1 provides a general introduction to the work presented in this thesis, with emphasis on the functions of various receptors in platelet adhesion, aggregation and thrombus formation in health and disease. In addition, this chapter gives an introduction into the current standards of antiplatelet therapy, and it summarizes recent advances in the targeting of GPVI and CLEC-2. In chapter 2, I show for the first time that the anti-mouse GPVI antibody JAQ1 does cross-react with human GPVI (huGPVI), but not with the GPVI orthologues of other tested mammalian species, such as rats, rabbits, guinea pigs, swine, and dogs. I further show that the JAQ1 antibody affects in part differently the functions of mouse and human platelet GPVI. Similarly, to mouse platelets, JAQ1 inhibits the activation process of human platelets, when induced by collagen-related peptide (CRP). However, unlike mouse platelets, it does not inhibit the collagen-induced adhesion, activation and aggregate formation of human platelets, but it instead causes an increased response. Furthermore, my results indicate that this enhanced effect is also present in the platelets from human GPVI knock-in (hGP6tg/tg) mice. In chapter 3, I have studied the temporal roles of different pathways of human platelet and coagulation activation, triggered by collagen and tissue factor (TF), respectively, in whole-blood thrombus formation. For this purpose, I adapted the microfluidics whole-blood assay using the Maastricht flow chamber to acutely intervene pharmacologically in the thrombus formation process at desired time points. With the help of this method, my experiments revealed time-restricted, yet crucial, roles of GPVI and Syk protein kinase as well as TF/factor VIIa-induced coagulation during the first two minutes of thrombus buildup. In order to block GPVI, I employed a novel anti-GPVI Fab, EMF-1. On the other hand, it appeared that the platelet activation processes through thrombin receptors (protease-activating receptors 1 and 4) and integrin αIIbβ3 were prolongedly active, and continued during later stages of thrombus formation. Finally, this work demonstrated a prominent role of the GPVI- and Syk-dependent signaling pathway in the generation of coagulation-active platelets, exposing the negatively charged phospholipid phosphatidylserine. Chapter 4 is a comprehensive study on the depletion of human GPVI (huGPVI) in mice using transgenic hGP6tg/tg mice. First, I show that treatment of the mice with the monoclonal antibody JAQ1 leads to the partial depletion of GPVI in vivo, thereby generating low-density GPVI (GPVILO) platelets, which were no longer responsive to the ligands CRP or convulxin. Blood from mice treated with JAQ1 showed an impaired capacity to generate platelet aggregates on collagen at arterial shear stress conditions in whole-blood flow studies. Additional studies with another anti-mouse GPVI monoclonal antibody JAQ4, in combination with wild-type mice, proved that the generation of the GPVILO platelet phenotype is dependent on low-affinity antibodies. Furthermore, in this chapter, I have demonstrated that the specific and high-affinity anti� huGPVI antibodies EMF-1 and EMF-2 are able to fully downregulate the receptor in hGP6tg/tg mice in vivo. In different experimental models, the EMF-1 IgG-treated mice appeared to be profoundly protected against occlusive arterial thrombus formation, whereas tail bleeding times were only minimally affected. With these results, I show that in vivo down-regulation of huGPVI has the potential to become a safe and effective strategy to target platelet activation and to treat thrombotic conditions. The work presented in chapter 5 describes the first characterization of a mouse line humanized for CLEC-2 (hCLEC-2 KI), and illustrates that these mice can help in the evaluation of novel therapeutics targeting CLEC-2. First, I show that the transgenic mice only expressing hCLEC-2 are indistinguishable from wildtype mice (with mouse CLEC� 2 receptors), in terms of blood-lymph vessel separation and organ development and morphology. I also prove that the platelets from hCLEC-2 KI mice become activated, aggregated and spread in a comparable way as wildtype platelets. An important finding is that the novel anti-hCLEC-2 antibody HEL-1 can completely downregulate hCLEC-2 in vivo; and furthermore, that this downregulation has no effect on hemostasis. On the other hand, I show that the hCLEC-2 KI mice present with an impaired thrombus formation after FeCl3-induced injury of mesenterial arterioles, in contrast to wildtype mice where complete vessel occlusion was observed in all tested arterioles. Paradoxically, the hCLEC-2 depletion in hCLEC-2 KI animals reverts the phenotype to a wildtype-like phenotype. Finally, in chapter 6 I discuss the results of this thesis, and critically compare these to the current literature. In particular, I emphasize the relevance and importance of platelet research on different GPVI-targeting strategies, the possibilities of the use of humanized mouse models in translational research, as well as the implications and challenges of future therapeutic strategies targeting CLEC-2.Die pharmakologische Hemmung der Thrombozytenaggregation ist eine bedeutende Behandlungsmethode zur Verringerung oder Verhinderung thrombotischer Ereignisse, die die Lebensqualität und Lebenserwartung von Patienten mit einem Herz- oder Hirninfarkt erhöht. Der aktuelle Goldstandard für Patienten ist die Verwendung von Aspirin und P2Y12-Rezeptor-Inhibitoren, die die Thrombozytenaktivierung durch Thromboxan A2 bzw. ADP - zwei wichtige second-wave Mediatoren - hemmen. Die Behandlung mit diesen dualen Thrombozyten-aggregationshemmern geht jedoch mit einem erhöhten Risiko für Blutungsereignisse einher. Die meiner Arbeit zu Grunde liegende Hypothese ist, dass die gezielte Modulation der liganden-induzierten Clusterbildung des Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) oder des Podoplaninrezeptors (C-Typ-Lektin-ähnlicher Rezeptor 2, CLEC-2) in Blutplättchen einen vergleichbaren anti-thrombotischen Schutz bietet, jedoch nur eine geringe Auswirkung auf die Hämostase hat. Um dies zu untersuchen, habe ich die Thrombose- und Hämostaseprofile von CRISPR-Cas9-modifizierten Mäusen, deren Blutplättchen jeweils die humane Form von GPVI oder CLEC-2 exprimieren, mit in vitro und in vivo Methoden charakterisiert. Darüber hinaus habe ich diese Mausmodelle verwendet, um neuartige Inhibitoren zu validieren, die gegen humanes GPVI oder CLEC-2 gerichtet sind. Kapitel 1 beinhaltet eine allgemeine Einführung in die Thematik dieser Dissertation. Der Schwerpunkt liegt auf der Beschreibung der Funktionen verschiedener Rezeptoren der Thrombozytenadhäsion, -aggregation und Thrombusbildung unter (patho-)physiologischen Bedingungen. Darüber hinaus gibt dieses Kapitel eine Einführung in die aktuellen Standards der Thrombozytenaggregationshemmung und fasst die jüngsten Fortschritte beim pharmakologischen Angreifen (targeting) von GPVI und CLEC-2 zusammen. In Kapitel 2 zeige ich erstmalig, dass der gegen murines GPVI gerichtete Antikörper JAQ1 mit humanem GPVI kreuzreagiert, aber nicht mit GPVI-Orthologen anderer getesteter Säugetierspezies (wie Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein und Hund). Ich zeige weiterhin, dass der JAQ1-Antikörper die Funktionen von murinen und menschlichem GPVI teils unterschiedlich beeinflusst. Ähnlich wie bei Mausthrombozyten hemmt JAQ1 den Aktivierungsprozess menschlicher Thrombozyten, wenn dieser durch ein synthetisches Collagenpeptid (collagen-related peptide, CRP) ausgelöst wird. Im Gegensatz zu Mausthrombozyten hemmt es jedoch nicht die Kollagen-induzierte Adhäsion, Aktivierung und Aggregatbildung menschlicher Blutplättchen, sondern bewirkt stattdessen eine verstärkte Antwort. Darüber hinaus deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass diese verstärkende Wirkung auch in den Blutplättchen von humanen GPVI-Knock-in (hGP6tg/tg)-Mäusen vorhanden ist. In Kapitel 3 habe ich die Zeitabhängigkeit verschiedener Signalwege der Thrombozyten- und Gerinnungsaktivierung bei der Bildung von Thromben - induziert durch Kollagen bzw. Gewebefaktor (tissue factor, TF) - im humanen Vollblut untersucht. Zu diesem Zweck habe ich den auf der Maastricht-Flusskammer basierenden Mikrofluidik-Vollbluttest angepasst, um zu gewünschten Zeitpunkten akut pharmakologisch in den Thrombusbildungsprozess einzugreifen. Mit Hilfe dieser Methode zeigten meine Experimente zeitlich begrenzte, aber entscheidende Rollen von GPVI und der Proteinkinase Syk sowie der von TF/Faktor VIIa-induzierten Gerinnung während der ersten zwei Minuten der Thrombusentstehung. Um GPVI zu blockieren, verwendete ich ein Fab Fragment eines neuen anti-GPVI-Antikörpers, EMF-1. Andererseits schienen die Aktivierungsprozesse durch die Thrombinrezeptoren (Protease-aktivierende Rezeptoren 1 und 4) und durch Integrin αIIbβ3 bis in späteren Stadien der Thrombusbildung fortlaufend aktiv zu sein. Schließlich zeigten diese Arbeiten eine entscheidende Rolle des GPVI- und Syk- abhängigen Signalwegs bei der Bildung von prokoagulatorischen Blutplättchen, die das negativ geladene Phospholipid Phosphatidylserin exponieren. Kapitel 4 ist eine umfassende Studie zur Depletion von humanem GPVI (huGPVI) in Mäusen unter Verwendung transgener hGP6tg/tg Mäuse. Zunächst zeige ich, dass die Behandlung dieser Tiere mit dem monoklonalen Antikörper JAQ1 zu einer partiellen Depletion von GPVI in vivo führt, wodurch Thrombozyten mit niedriger GPVI-Dichte (GPVILO) erzeugt werden, die nicht mehr auf die Liganden CRP oder Convulxin ansprechen. Das Blut JAQ1-behandelter Mäuse zeigte in Vollblut-Flusskammerstudien eine beeinträchtigte Bildung von Thrombozytenaggregaten auf Kollagen unter arteriellen Flussbedingungen. Zusätzliche Studien mit einem anderen monoklonalen anti-Maus-GPVI-Antikörper, JAQ4, in Kombination mit Wildtypmäusen zeigten, dass die Erzeugung des GPVILO-Thrombozytenphänotyps von Antikörpern mit niedriger Affinität abhängig ist. Die spezifischen und hochaffinen anti-huGPVI-Antikörper EMF- 1 und EMF-2 waren der Lage, den Rezeptor in hGP6tg/tg-Mäusen in vivo vollständig herunterzuregulieren. Die mit EMF-1 IgG behandelten hGP6tg/tg Mäuse waren in verschiedenen experimentellen Modellen stark gegen die Bildung von okklusiven arteriellen Thromben geschützt, während die Blutungszeiten bei Amputation der Schwanzspitze nur minimal beeinflusst wurden. Dies zeigt, dass die in vivo Herunterregulierung von huGPVI das Potenzial hat, eine sichere und wirksame Strategie zu werden, um die Thrombozytenaktivierung anzugreifen und thrombotische Erkrankungen zu behandeln. Die in Kapitel 5 vorgestellte Arbeiten beschreiben die erstmalige Charakterisierung einer CLEC-2 humanisierten Mauslinie (hCLEC-2KI) und legt dar, dass diese bei der Beurteilung neuer Therapeutika gegen CLEC-2 hilfreich sein kann. Eingangs zeige ich, dass die transgenen Mäuse, die nur hCLEC-2 exprimieren, sich nicht von Wildtyp- Mäusen (mit murinen CLEC-2-Rezeptoren) in Bezug auf Blut-Lymphgefäß-Trennung und Organentwicklung und -morphologie unterscheiden. Ebenso können die Thrombozyten von hCLEC-2KI Mäusen vergleichbar wie Wildtyp-Thrombozyten aktiviert werden, sowie aggregieren und spreaden. Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass der neuartige anti-hCLEC-2-Antikörper, HEL-1, hCLEC-2 in vivo vollständig herunterregulieren kann und dass diese Herunterregulierung keine Auswirkung auf die Hämostase hat. Andererseits zeigte sich, dass hCLEC-2KI Tiere nach FeCl3-induzierter Verletzung mesenterialer Arteriolen eine gestörte Thrombusbildung aufweisen - im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen, bei denen in allen getesteten Arteriolen ein vollständiger Gefäßverschluss beobachtet wurde. Paradoxerweise stellt die hCLEC-2- Depletion in hCLEC-2KI-Tieren einen Wildtyp-ähnlichen Phänotyp wieder her. Abschließend diskutiere ich in Kapitel 6 die Ergebnisse dieser Arbeit und vergleiche diese kritisch mit der aktuellen Literatur. Insbesondere betone ich die Relevanz und Bedeutung der Untersuchung und Erforschung verschiedener GPVI-targeting Strategien, die Möglichkeiten der Verwendung humanisierter Mausmodelle in der translationalen Forschung sowie die Implikationen und Herausforderungen zukünftiger therapeutischer Strategien, die auf CLEC-2 abzielen

Erweiterung der Werkzeugkiste für Virusbildgebung durch Bioorthogonale Markierung von SARS-CoV-2 Spike-pseudotypisierten Viren

The events of the SARS-CoV-2 pandemic highlight the importance of scientific investigations of viral infection. A heightened interest is placed on the elucidation of the earliest stages of infection. Identifying target host proteins, understanding uptake mechanisms, and discerning processing pathways of viruses can aid in pinpointing potential therapeutics and provide detailed insights into the mechanisms of infection. Fluorescence microscopy presents an ideally suited method for such studies. However, microscopic investigations of viral infections are limited by the small size of viral particles. As most virions are of a size well below the diffraction limit, structural imaging of such particles can only be performed by applying modern super-resolution microscopy. A challenge remains in finding a suitable method to introduce a fluorescent label onto viruses. Implementing common immunostaining techniques utilize antibodies of ~10 nm size as labels, which make up a significant portion of the entire virion's size. Furthermore, these labels can introduce unwanted effects during infections, as antibodies can neutralize the viral glycopro-teins, necessary for host-cell binding. Other fluorescent tags, such as fusion proteins, have been shown to interfere with virus assembly. In this thesis the method of pseudotyping vesicular stomatitis viruses was combined with genetic code expansion to introduce a click-chemistry addressable tag directly onto SARS-CoV-2 Spike proteins. This yielded highly fluorescent viruses capable of a single round of infection. These particles can be studied under reduced biosafety levels, and the minimal size of the label has been demonstrated to not impede infection. We termed these particles “clickVSV”. Infection studies using VERO E6 cells expressing angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) demonstrated that clickVSVs could be utilized for neutralizing agent screening, while individual virions remained detectable under microscopy. Utilizing clickVSVs, we achieved robust particle tracking during live-cell infection experiments with lattice light-sheet microscopy. Using the same system, the infection was imaged from attachment to the clickVSV induced GFP expression in host-cells. In super-resolution imaging by direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) we found that the size and shape of these particles is consistent with structural data from earlier studies. In addition, implementing click chemistry offered advantages in labeling efficiency compared to immunostaining and allowed for more accurate quantification of Spike proteins on the virions. Additionally, clickVSVs serve as an ideal reference structure for nanometer resolution imaging, especially when combining dSTORM with expansion microscopy. As click-chemistry can reduce the linkage error between fluorophore and protein of interest it is of special interest for protein labeling in expansion microscopy. Part of this thesis evaluates the potential of three distinct click groups, along with a biotin-streptavidin pairing for post-expansion labeling. Here azide- and biotin-groups emerged as valuable protein modifications to ensure efficient stainings after sample expansion. Finally, we utilized dSTORM to quantify the oncoprotein MYC in U2OS cells and examined its distribution in perturbed, overexpressed and stress conditions. It was shown that MYC forms sphere-like multimeric structures which are involved in shielding stalled replication forks. Under stress conditions an enhanced formation of these foci was observed. The findings contributed to a study, suggesting that multimerization of MYC under stress conditions might enable the proliferation of tumor cells.Die Ereignisse der SARS-CoV-2-Pandemie unterstreichen die Bedeutung wissenschaftlicher Untersuchungen von Virusinfektionen. Ein erhöhtes Interesse besteht in der Aufklärung der frühesten Infektionsstadien. Das Identifizieren von Wirtszielproteinen der Viren, das Verstehen von Aufnahmemechanismen und das Erkennen von Verarbeitungswegen der Viren können helfen, potenzielle Therapeutika zu identifizieren und detaillierte Einblicke in die Infektionsmechanismen zu geben. Die Fluoreszenzmikroskopie stellt eine ideal geeignete Methode für solche Studien dar. Allerdings sind mikroskopische Untersuchungen von Virusinfektionen durch die geringe Größe der Viruspartikel begrenzt. Da die meisten Viren eine Größe weit unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts haben, kann die strukturelle Abbildung solcher Partikel nur durch Anwendung moderner, hochauflösender Mikroskopie erfolgen. Jedoch besteht eine Herausforderung darin, geeignete Methoden zu finden, um ein Fluorophor auf Viren anzubringen. Übliche Immunfärbetechniken nutzen Antikörper von ~10 nm Größe als Proben, die einen erheblichen Anteil der gesamten Virionsgröße ausmachen. Darüber hinaus können diese Proben unerwünschte Effekte während Infektionen hervorrufen, da Antikörper die viralen Glykoproteine, die für die Bindung an Wirtszellen notwendig sind, neutralisieren können. Andere fluoreszierende Marker, wie Fusionsproteine, haben sich als störend für die Virusassemblierung erwiesen. In dieser Arbeit wurde die Methode der Pseudotypisierung von vesikulären Stomatitisviren mit der Erweiterung des genetischen Codes kombiniert, um eine mit Click-Chemie adressierbare Modifikation direkt auf SARS-CoV-2 Spike-Proteinen einzuführen. Dies generierte hoch fluoreszierende Viren, die zu einer einzigen Infektionsrunde fähig sind. Diese Partikel können unter reduzierten Biosicherheitsbedingungen untersucht werden, und es wurde gezeigt, dass die minimale Größe der Modifikation die Infektion nicht beeinträchtigt. Wir haben diese Partikel „clickVSV“ genannt. Infektionsstudien mit VERO E6-Zellen, die das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) exprimieren, zeigten, dass clickVSVs zu dem Screening von Neutralisationsmitteln verwendet werden können, während einzelne Viren unter dem Mikroskop noch nachweisbar blieben. Mit clickVSVs gelang es uns, Partikel während lebend-Zell-Infektionsexperimenten mit Gitter-Lichtblattmikroskopie robust zu verfolgen. Mit demselben System wurde die Infektion vom Anhaften bis zur durch clickVSV induzierten GFP-Expression in Wirtszellen abgebildet. In der hochauflösenden Bildgebung durch direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) fanden wir, dass die Größe und Form dieser Partikel mit strukturellen Daten aus früheren Studien übereinstimmen. Darüber hinaus bot die Anwendung von Click-Chemie Vorteile bei der Markierungseffizienz im Vergleich zur Immunfärbung und ermöglichte eine genauere Quantifizierung von Spike-Proteinen auf den Viren. Außerdem eignen sich clickVSVs als ideale Referenzstruktur für die Bildgebung im Nanometerbereich, insbesondere bei der Kombination von dSTORM mit Expansionsmikroskopie. Da Click-Chemie den Kopplungsfehler zwischen Fluorophor und Protein reduzieren kann, ist sie von besonderem Interesse für die Markierung in der Expansionsmikroskopie. Ein Teil dieser Arbeit bewertet das Potential von drei verschiedenen Click-Gruppen, zusammen mit einer Biotin-Streptavidin-Kopplung für die Nachexpansionsfärbung. Hier zeigten sich Azid- und Biotin-Gruppen als wertvolle Proteinmodifikationen, um effiziente Färbungen nach Probenaus-dehnung zu gewährleisten. Schließlich nutzten wir dSTORM, um das Onkoprotein MYC in U2OS-Zellen zu quantifizieren und dessen Verteilung unter gestörten, überexprimierten und Stressbedingungen zu unter-suchen. Es wurde gezeigt, dass MYC kugelähnliche multimerische Strukturen bildet, die an der Abschirmung von gestoppten Replikationsgabeln beteiligt sind. Unter Stressbedingungen wurde eine erhöhte Bildung dieser „Foki“ beobachtet. Die Ergebnisse trugen zu einer Studie bei, die nahelegt, dass die Multimerisierung von MYC unter Stressbedingungen die Proliferation von Tumorzellen ermöglichen könnte