Erweiterung der Werkzeugkiste für Virusbildgebung durch Bioorthogonale Markierung von SARS-CoV-2 Spike-pseudotypisierten Viren

Abstract

The events of the SARS-CoV-2 pandemic highlight the importance of scientific investigations of viral infection. A heightened interest is placed on the elucidation of the earliest stages of infection. Identifying target host proteins, understanding uptake mechanisms, and discerning processing pathways of viruses can aid in pinpointing potential therapeutics and provide detailed insights into the mechanisms of infection. Fluorescence microscopy presents an ideally suited method for such studies. However, microscopic investigations of viral infections are limited by the small size of viral particles. As most virions are of a size well below the diffraction limit, structural imaging of such particles can only be performed by applying modern super-resolution microscopy. A challenge remains in finding a suitable method to introduce a fluorescent label onto viruses. Implementing common immunostaining techniques utilize antibodies of ~10 nm size as labels, which make up a significant portion of the entire virion's size. Furthermore, these labels can introduce unwanted effects during infections, as antibodies can neutralize the viral glycopro-teins, necessary for host-cell binding. Other fluorescent tags, such as fusion proteins, have been shown to interfere with virus assembly. In this thesis the method of pseudotyping vesicular stomatitis viruses was combined with genetic code expansion to introduce a click-chemistry addressable tag directly onto SARS-CoV-2 Spike proteins. This yielded highly fluorescent viruses capable of a single round of infection. These particles can be studied under reduced biosafety levels, and the minimal size of the label has been demonstrated to not impede infection. We termed these particles “clickVSV”. Infection studies using VERO E6 cells expressing angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) demonstrated that clickVSVs could be utilized for neutralizing agent screening, while individual virions remained detectable under microscopy. Utilizing clickVSVs, we achieved robust particle tracking during live-cell infection experiments with lattice light-sheet microscopy. Using the same system, the infection was imaged from attachment to the clickVSV induced GFP expression in host-cells. In super-resolution imaging by direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) we found that the size and shape of these particles is consistent with structural data from earlier studies. In addition, implementing click chemistry offered advantages in labeling efficiency compared to immunostaining and allowed for more accurate quantification of Spike proteins on the virions. Additionally, clickVSVs serve as an ideal reference structure for nanometer resolution imaging, especially when combining dSTORM with expansion microscopy. As click-chemistry can reduce the linkage error between fluorophore and protein of interest it is of special interest for protein labeling in expansion microscopy. Part of this thesis evaluates the potential of three distinct click groups, along with a biotin-streptavidin pairing for post-expansion labeling. Here azide- and biotin-groups emerged as valuable protein modifications to ensure efficient stainings after sample expansion. Finally, we utilized dSTORM to quantify the oncoprotein MYC in U2OS cells and examined its distribution in perturbed, overexpressed and stress conditions. It was shown that MYC forms sphere-like multimeric structures which are involved in shielding stalled replication forks. Under stress conditions an enhanced formation of these foci was observed. The findings contributed to a study, suggesting that multimerization of MYC under stress conditions might enable the proliferation of tumor cells.Die Ereignisse der SARS-CoV-2-Pandemie unterstreichen die Bedeutung wissenschaftlicher Untersuchungen von Virusinfektionen. Ein erhöhtes Interesse besteht in der Aufklärung der frühesten Infektionsstadien. Das Identifizieren von Wirtszielproteinen der Viren, das Verstehen von Aufnahmemechanismen und das Erkennen von Verarbeitungswegen der Viren können helfen, potenzielle Therapeutika zu identifizieren und detaillierte Einblicke in die Infektionsmechanismen zu geben. Die Fluoreszenzmikroskopie stellt eine ideal geeignete Methode für solche Studien dar. Allerdings sind mikroskopische Untersuchungen von Virusinfektionen durch die geringe Größe der Viruspartikel begrenzt. Da die meisten Viren eine Größe weit unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts haben, kann die strukturelle Abbildung solcher Partikel nur durch Anwendung moderner, hochauflösender Mikroskopie erfolgen. Jedoch besteht eine Herausforderung darin, geeignete Methoden zu finden, um ein Fluorophor auf Viren anzubringen. Übliche Immunfärbetechniken nutzen Antikörper von ~10 nm Größe als Proben, die einen erheblichen Anteil der gesamten Virionsgröße ausmachen. Darüber hinaus können diese Proben unerwünschte Effekte während Infektionen hervorrufen, da Antikörper die viralen Glykoproteine, die für die Bindung an Wirtszellen notwendig sind, neutralisieren können. Andere fluoreszierende Marker, wie Fusionsproteine, haben sich als störend für die Virusassemblierung erwiesen. In dieser Arbeit wurde die Methode der Pseudotypisierung von vesikulären Stomatitisviren mit der Erweiterung des genetischen Codes kombiniert, um eine mit Click-Chemie adressierbare Modifikation direkt auf SARS-CoV-2 Spike-Proteinen einzuführen. Dies generierte hoch fluoreszierende Viren, die zu einer einzigen Infektionsrunde fähig sind. Diese Partikel können unter reduzierten Biosicherheitsbedingungen untersucht werden, und es wurde gezeigt, dass die minimale Größe der Modifikation die Infektion nicht beeinträchtigt. Wir haben diese Partikel „clickVSV“ genannt. Infektionsstudien mit VERO E6-Zellen, die das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) exprimieren, zeigten, dass clickVSVs zu dem Screening von Neutralisationsmitteln verwendet werden können, während einzelne Viren unter dem Mikroskop noch nachweisbar blieben. Mit clickVSVs gelang es uns, Partikel während lebend-Zell-Infektionsexperimenten mit Gitter-Lichtblattmikroskopie robust zu verfolgen. Mit demselben System wurde die Infektion vom Anhaften bis zur durch clickVSV induzierten GFP-Expression in Wirtszellen abgebildet. In der hochauflösenden Bildgebung durch direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) fanden wir, dass die Größe und Form dieser Partikel mit strukturellen Daten aus früheren Studien übereinstimmen. Darüber hinaus bot die Anwendung von Click-Chemie Vorteile bei der Markierungseffizienz im Vergleich zur Immunfärbung und ermöglichte eine genauere Quantifizierung von Spike-Proteinen auf den Viren. Außerdem eignen sich clickVSVs als ideale Referenzstruktur für die Bildgebung im Nanometerbereich, insbesondere bei der Kombination von dSTORM mit Expansionsmikroskopie. Da Click-Chemie den Kopplungsfehler zwischen Fluorophor und Protein reduzieren kann, ist sie von besonderem Interesse für die Markierung in der Expansionsmikroskopie. Ein Teil dieser Arbeit bewertet das Potential von drei verschiedenen Click-Gruppen, zusammen mit einer Biotin-Streptavidin-Kopplung für die Nachexpansionsfärbung. Hier zeigten sich Azid- und Biotin-Gruppen als wertvolle Proteinmodifikationen, um effiziente Färbungen nach Probenaus-dehnung zu gewährleisten. Schließlich nutzten wir dSTORM, um das Onkoprotein MYC in U2OS-Zellen zu quantifizieren und dessen Verteilung unter gestörten, überexprimierten und Stressbedingungen zu unter-suchen. Es wurde gezeigt, dass MYC kugelähnliche multimerische Strukturen bildet, die an der Abschirmung von gestoppten Replikationsgabeln beteiligt sind. Unter Stressbedingungen wurde eine erhöhte Bildung dieser „Foki“ beobachtet. Die Ergebnisse trugen zu einer Studie bei, die nahelegt, dass die Multimerisierung von MYC unter Stressbedingungen die Proliferation von Tumorzellen ermöglichen könnte