Charakterisierung neuer Ansätze zur pharmakologischen Modulation der Thrombozytenrezeptoren GPVI und CLEC-2 in humanisierten Mausmodellen

Abstract

Antiplatelet therapy plays an important role in reducing or preventing (the risk of) thrombotic events, thus increasing life quality and expectancy of patients with a heart or brain infarction. Nowadays, the gold standard for such patients is the use of aspirin and P2Y12 receptor inhibitors, targeting platelet activation processes dependent on thromboxane A2 and ADP, respectively, both of which are important second mediators of platelet activation. However, treatment with dual antiplatelet drugs coincides with an increased risk of bleeding events. In this thesis, my hypothesis is that the targeted modulation in platelets of ligand-induced clustering of the collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) or the podoplanin receptor (C-type lectin-like receptor 2, CLEC-2) provides anti-thrombotic protection with minimal effect on normal hemostasis. To address this, I have characterized the thrombosis and hemostasis profiles of CRISPR-Cas9-modified mice with platelets expressing the human form of GPVI or CLEC-2 receptors, using both in vitro and in vivo methods. In addition, I have used these mouse models to validate novel inhibitors directed against human GPVI or CLEC-2. Chapter 1 provides a general introduction to the work presented in this thesis, with emphasis on the functions of various receptors in platelet adhesion, aggregation and thrombus formation in health and disease. In addition, this chapter gives an introduction into the current standards of antiplatelet therapy, and it summarizes recent advances in the targeting of GPVI and CLEC-2. In chapter 2, I show for the first time that the anti-mouse GPVI antibody JAQ1 does cross-react with human GPVI (huGPVI), but not with the GPVI orthologues of other tested mammalian species, such as rats, rabbits, guinea pigs, swine, and dogs. I further show that the JAQ1 antibody affects in part differently the functions of mouse and human platelet GPVI. Similarly, to mouse platelets, JAQ1 inhibits the activation process of human platelets, when induced by collagen-related peptide (CRP). However, unlike mouse platelets, it does not inhibit the collagen-induced adhesion, activation and aggregate formation of human platelets, but it instead causes an increased response. Furthermore, my results indicate that this enhanced effect is also present in the platelets from human GPVI knock-in (hGP6tg/tg) mice. In chapter 3, I have studied the temporal roles of different pathways of human platelet and coagulation activation, triggered by collagen and tissue factor (TF), respectively, in whole-blood thrombus formation. For this purpose, I adapted the microfluidics whole-blood assay using the Maastricht flow chamber to acutely intervene pharmacologically in the thrombus formation process at desired time points. With the help of this method, my experiments revealed time-restricted, yet crucial, roles of GPVI and Syk protein kinase as well as TF/factor VIIa-induced coagulation during the first two minutes of thrombus buildup. In order to block GPVI, I employed a novel anti-GPVI Fab, EMF-1. On the other hand, it appeared that the platelet activation processes through thrombin receptors (protease-activating receptors 1 and 4) and integrin αIIbβ3 were prolongedly active, and continued during later stages of thrombus formation. Finally, this work demonstrated a prominent role of the GPVI- and Syk-dependent signaling pathway in the generation of coagulation-active platelets, exposing the negatively charged phospholipid phosphatidylserine. Chapter 4 is a comprehensive study on the depletion of human GPVI (huGPVI) in mice using transgenic hGP6tg/tg mice. First, I show that treatment of the mice with the monoclonal antibody JAQ1 leads to the partial depletion of GPVI in vivo, thereby generating low-density GPVI (GPVILO) platelets, which were no longer responsive to the ligands CRP or convulxin. Blood from mice treated with JAQ1 showed an impaired capacity to generate platelet aggregates on collagen at arterial shear stress conditions in whole-blood flow studies. Additional studies with another anti-mouse GPVI monoclonal antibody JAQ4, in combination with wild-type mice, proved that the generation of the GPVILO platelet phenotype is dependent on low-affinity antibodies. Furthermore, in this chapter, I have demonstrated that the specific and high-affinity anti� huGPVI antibodies EMF-1 and EMF-2 are able to fully downregulate the receptor in hGP6tg/tg mice in vivo. In different experimental models, the EMF-1 IgG-treated mice appeared to be profoundly protected against occlusive arterial thrombus formation, whereas tail bleeding times were only minimally affected. With these results, I show that in vivo down-regulation of huGPVI has the potential to become a safe and effective strategy to target platelet activation and to treat thrombotic conditions. The work presented in chapter 5 describes the first characterization of a mouse line humanized for CLEC-2 (hCLEC-2 KI), and illustrates that these mice can help in the evaluation of novel therapeutics targeting CLEC-2. First, I show that the transgenic mice only expressing hCLEC-2 are indistinguishable from wildtype mice (with mouse CLEC� 2 receptors), in terms of blood-lymph vessel separation and organ development and morphology. I also prove that the platelets from hCLEC-2 KI mice become activated, aggregated and spread in a comparable way as wildtype platelets. An important finding is that the novel anti-hCLEC-2 antibody HEL-1 can completely downregulate hCLEC-2 in vivo; and furthermore, that this downregulation has no effect on hemostasis. On the other hand, I show that the hCLEC-2 KI mice present with an impaired thrombus formation after FeCl3-induced injury of mesenterial arterioles, in contrast to wildtype mice where complete vessel occlusion was observed in all tested arterioles. Paradoxically, the hCLEC-2 depletion in hCLEC-2 KI animals reverts the phenotype to a wildtype-like phenotype. Finally, in chapter 6 I discuss the results of this thesis, and critically compare these to the current literature. In particular, I emphasize the relevance and importance of platelet research on different GPVI-targeting strategies, the possibilities of the use of humanized mouse models in translational research, as well as the implications and challenges of future therapeutic strategies targeting CLEC-2.Die pharmakologische Hemmung der Thrombozytenaggregation ist eine bedeutende Behandlungsmethode zur Verringerung oder Verhinderung thrombotischer Ereignisse, die die Lebensqualität und Lebenserwartung von Patienten mit einem Herz- oder Hirninfarkt erhöht. Der aktuelle Goldstandard für Patienten ist die Verwendung von Aspirin und P2Y12-Rezeptor-Inhibitoren, die die Thrombozytenaktivierung durch Thromboxan A2 bzw. ADP - zwei wichtige second-wave Mediatoren - hemmen. Die Behandlung mit diesen dualen Thrombozyten-aggregationshemmern geht jedoch mit einem erhöhten Risiko für Blutungsereignisse einher. Die meiner Arbeit zu Grunde liegende Hypothese ist, dass die gezielte Modulation der liganden-induzierten Clusterbildung des Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) oder des Podoplaninrezeptors (C-Typ-Lektin-ähnlicher Rezeptor 2, CLEC-2) in Blutplättchen einen vergleichbaren anti-thrombotischen Schutz bietet, jedoch nur eine geringe Auswirkung auf die Hämostase hat. Um dies zu untersuchen, habe ich die Thrombose- und Hämostaseprofile von CRISPR-Cas9-modifizierten Mäusen, deren Blutplättchen jeweils die humane Form von GPVI oder CLEC-2 exprimieren, mit in vitro und in vivo Methoden charakterisiert. Darüber hinaus habe ich diese Mausmodelle verwendet, um neuartige Inhibitoren zu validieren, die gegen humanes GPVI oder CLEC-2 gerichtet sind. Kapitel 1 beinhaltet eine allgemeine Einführung in die Thematik dieser Dissertation. Der Schwerpunkt liegt auf der Beschreibung der Funktionen verschiedener Rezeptoren der Thrombozytenadhäsion, -aggregation und Thrombusbildung unter (patho-)physiologischen Bedingungen. Darüber hinaus gibt dieses Kapitel eine Einführung in die aktuellen Standards der Thrombozytenaggregationshemmung und fasst die jüngsten Fortschritte beim pharmakologischen Angreifen (targeting) von GPVI und CLEC-2 zusammen. In Kapitel 2 zeige ich erstmalig, dass der gegen murines GPVI gerichtete Antikörper JAQ1 mit humanem GPVI kreuzreagiert, aber nicht mit GPVI-Orthologen anderer getesteter Säugetierspezies (wie Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Schwein und Hund). Ich zeige weiterhin, dass der JAQ1-Antikörper die Funktionen von murinen und menschlichem GPVI teils unterschiedlich beeinflusst. Ähnlich wie bei Mausthrombozyten hemmt JAQ1 den Aktivierungsprozess menschlicher Thrombozyten, wenn dieser durch ein synthetisches Collagenpeptid (collagen-related peptide, CRP) ausgelöst wird. Im Gegensatz zu Mausthrombozyten hemmt es jedoch nicht die Kollagen-induzierte Adhäsion, Aktivierung und Aggregatbildung menschlicher Blutplättchen, sondern bewirkt stattdessen eine verstärkte Antwort. Darüber hinaus deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass diese verstärkende Wirkung auch in den Blutplättchen von humanen GPVI-Knock-in (hGP6tg/tg)-Mäusen vorhanden ist. In Kapitel 3 habe ich die Zeitabhängigkeit verschiedener Signalwege der Thrombozyten- und Gerinnungsaktivierung bei der Bildung von Thromben - induziert durch Kollagen bzw. Gewebefaktor (tissue factor, TF) - im humanen Vollblut untersucht. Zu diesem Zweck habe ich den auf der Maastricht-Flusskammer basierenden Mikrofluidik-Vollbluttest angepasst, um zu gewünschten Zeitpunkten akut pharmakologisch in den Thrombusbildungsprozess einzugreifen. Mit Hilfe dieser Methode zeigten meine Experimente zeitlich begrenzte, aber entscheidende Rollen von GPVI und der Proteinkinase Syk sowie der von TF/Faktor VIIa-induzierten Gerinnung während der ersten zwei Minuten der Thrombusentstehung. Um GPVI zu blockieren, verwendete ich ein Fab Fragment eines neuen anti-GPVI-Antikörpers, EMF-1. Andererseits schienen die Aktivierungsprozesse durch die Thrombinrezeptoren (Protease-aktivierende Rezeptoren 1 und 4) und durch Integrin αIIbβ3 bis in späteren Stadien der Thrombusbildung fortlaufend aktiv zu sein. Schließlich zeigten diese Arbeiten eine entscheidende Rolle des GPVI- und Syk- abhängigen Signalwegs bei der Bildung von prokoagulatorischen Blutplättchen, die das negativ geladene Phospholipid Phosphatidylserin exponieren. Kapitel 4 ist eine umfassende Studie zur Depletion von humanem GPVI (huGPVI) in Mäusen unter Verwendung transgener hGP6tg/tg Mäuse. Zunächst zeige ich, dass die Behandlung dieser Tiere mit dem monoklonalen Antikörper JAQ1 zu einer partiellen Depletion von GPVI in vivo führt, wodurch Thrombozyten mit niedriger GPVI-Dichte (GPVILO) erzeugt werden, die nicht mehr auf die Liganden CRP oder Convulxin ansprechen. Das Blut JAQ1-behandelter Mäuse zeigte in Vollblut-Flusskammerstudien eine beeinträchtigte Bildung von Thrombozytenaggregaten auf Kollagen unter arteriellen Flussbedingungen. Zusätzliche Studien mit einem anderen monoklonalen anti-Maus-GPVI-Antikörper, JAQ4, in Kombination mit Wildtypmäusen zeigten, dass die Erzeugung des GPVILO-Thrombozytenphänotyps von Antikörpern mit niedriger Affinität abhängig ist. Die spezifischen und hochaffinen anti-huGPVI-Antikörper EMF- 1 und EMF-2 waren der Lage, den Rezeptor in hGP6tg/tg-Mäusen in vivo vollständig herunterzuregulieren. Die mit EMF-1 IgG behandelten hGP6tg/tg Mäuse waren in verschiedenen experimentellen Modellen stark gegen die Bildung von okklusiven arteriellen Thromben geschützt, während die Blutungszeiten bei Amputation der Schwanzspitze nur minimal beeinflusst wurden. Dies zeigt, dass die in vivo Herunterregulierung von huGPVI das Potenzial hat, eine sichere und wirksame Strategie zu werden, um die Thrombozytenaktivierung anzugreifen und thrombotische Erkrankungen zu behandeln. Die in Kapitel 5 vorgestellte Arbeiten beschreiben die erstmalige Charakterisierung einer CLEC-2 humanisierten Mauslinie (hCLEC-2KI) und legt dar, dass diese bei der Beurteilung neuer Therapeutika gegen CLEC-2 hilfreich sein kann. Eingangs zeige ich, dass die transgenen Mäuse, die nur hCLEC-2 exprimieren, sich nicht von Wildtyp- Mäusen (mit murinen CLEC-2-Rezeptoren) in Bezug auf Blut-Lymphgefäß-Trennung und Organentwicklung und -morphologie unterscheiden. Ebenso können die Thrombozyten von hCLEC-2KI Mäusen vergleichbar wie Wildtyp-Thrombozyten aktiviert werden, sowie aggregieren und spreaden. Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass der neuartige anti-hCLEC-2-Antikörper, HEL-1, hCLEC-2 in vivo vollständig herunterregulieren kann und dass diese Herunterregulierung keine Auswirkung auf die Hämostase hat. Andererseits zeigte sich, dass hCLEC-2KI Tiere nach FeCl3-induzierter Verletzung mesenterialer Arteriolen eine gestörte Thrombusbildung aufweisen - im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen, bei denen in allen getesteten Arteriolen ein vollständiger Gefäßverschluss beobachtet wurde. Paradoxerweise stellt die hCLEC-2- Depletion in hCLEC-2KI-Tieren einen Wildtyp-ähnlichen Phänotyp wieder her. Abschließend diskutiere ich in Kapitel 6 die Ergebnisse dieser Arbeit und vergleiche diese kritisch mit der aktuellen Literatur. Insbesondere betone ich die Relevanz und Bedeutung der Untersuchung und Erforschung verschiedener GPVI-targeting Strategien, die Möglichkeiten der Verwendung humanisierter Mausmodelle in der translationalen Forschung sowie die Implikationen und Herausforderungen zukünftiger therapeutischer Strategien, die auf CLEC-2 abzielen