Modulation of Estrogen Response Element-Driven Gene Expressions and Cellular Proliferation with Polar Directions by Designer Transcription Regulators

<div><p>Estrogen receptor α (ERα), as a ligand-dependent transcription factor, mediates 17β-estradiol (E2) effects. ERα is a modular protein containing a DNA binding domain (DBD) and transcription activation domains (AD) located at the amino- and carboxyl-termini. The interaction of the E2-activated ERα dimer with estrogen response elements (EREs) of genes constitutes the initial step in the ERE-dependent signaling pathway necessary for alterations of cellular features. We previously constructed monomeric transcription activators, or monotransactivators, assembled from an engineered ERE-binding module (EBM) using the ERα-DBD and constitutively active ADs from other transcription factors. Monotransactivators modulated cell proliferation by activating and repressing ERE-driven gene expressions that simulate responses observed with E2-ERα. We reasoned here that integration of potent heterologous repression domains (RDs) into EBM could generate monotransrepressors that alter ERE-bearing gene expressions and cellular proliferation in directions opposite to those observed with E2-ERα or monotransactivators. Consistent with this, monotransrepressors suppressed reporter gene expressions that emulate the ERE-dependent signaling pathway. Moreover, a model monotransrepressor regulated DNA synthesis, cell cycle progression and proliferation of recombinant adenovirus infected ER-negative cells through decreasing as well as increasing gene expressions with polar directions compared with E2-ERα or monotransactivator. Our results indicate that an ‘activator’ or a ‘repressor’ possesses both transcription activating/enhancing and repressing/decreasing abilities within a chromatin context. Offering a protein engineering platform to alter signal pathway-specific gene expressions and cell growth, our approach could also be used for the development of tools for epigenetic modifications and for clinical interventions wherein multigenic de-regulations are an issue.</p></div

Meme kanseri tedavisine yönelik işlevleri kontrol edilebilir yapay transkripsiyon baskılayıcıların geliştirilmesi

TÜBİTAK TBAG Proje01.04.201617β-östradiyol (E2) meme dokusu dahil bir çok doku ve organın fizyolojik ve patofizyolojik regulasyonunda önemli rol oynar. E2, hedef doku hücre işlevlerini östrojen reseptörü (ER)’ne bağlanarak sağlar. Modüler doğalı bir transkripsiyon faktörü olan ER özel DNA dizileri olan Östrojen Yanıt Elemanları’na (ERE) bağlanarak hücre çoğalımı ve ölümününde rol oynayan gen ifadelerini düzenler. E2-ER sinyalinin hücrelerdeki temel rolü nedeniyle güncel meme kanseri tedavi yaklaşımları, E2 sentezini sağlayan enzimleri baskılayarak dolaşımdaki E2 miktarını azaltmayı veya E2 antagonistleri kullanarak ER işlevini önlemeyi amaçlar. Başlangıçta etkin yaklaşımlar olmalarına rağmen, hastalar zaman içerisinde bu tedavilere direnç geliştirirler. Bu da, güncel tedavi yaklaşımlarını yetersiz kılmakta ve yeni yöntemlerin geliştirilmesini zorunlu hale getirmektedir. ERE-bağımlı gen ifadelerinin hücre işlevlerindeki önemi nedeniyle, gen transkripsiyonlarının E2-ER’den bağımsız olarak düzenlenmesinin yeni tedavi yaklaşımlarına yol açabileceğini öngördük. Bu amaçla, ER’in modüler doğasından yararlanarak ERE’ye bağlanabilen protein modülü inşa ettik. Diğer transkripsiyon faktörlerinden elde ettiğimiz aktivasyon veya repressör ünitelerini bu modüle genetik olarak ekleyerek monotransaktivatör veya monotransrepresör proteinleri geliştirdik. ER-negatif meme kanseri model hücrelerinde yaptığımız çalışmalarda, monotransaktivatörün ERE-güdümlü gen ifadelerini E2-ER’ye benzer şekilde düzenleyerek hücre çoğlamasını baskıladığını bulguladık. Beklentimize koşut olarak, monotransrepressör ERE-güdümlü gene ifadelerini E2-ER’ye göre tam tersi yönlerde regüle ederek hücre çoğalmasını arttırdı. Bulgularımızı Ağustos-2015’te Plos One dergisinde yayınladık. Süregelen çalışmalarımızda, monotransrepressörlerin ER-pozitif model hücrelerde de ERE-bağımlı gen ifadelerini E2- ER’ye ters-yönde düzenlemesine rağmen hücre çoğalmasını öngörümüze karşıt olarak E2- ER’e benzer şekilde arttırdığını bulguladık. Gen ifadelerini E2-ER’ye koşut olarak düzenleyen monotransaktivatörler ise E2-ER’nin tam tersine hücre çoğlamasını baskıladı. Bu sonuçlar, gen ifadelerini E2-ER’den bağımsız düzenleyebilen monotransregülatörlerin hücre çoğalmasına etkilerinin hücre tipine bağlı olduğunu ve E2-ER sinyalinin farklı mekanizmalar kullanarak hücre çoğalmasını etkilediğini önermektedir. Kavram-kanıtlama olarak değerlendirdiğimiz bu bulgularımız, yaklaşımımızın biyolojik bilimlerde ve tıp alanlarında yeni deney ve tedavi sistemlerinin geliştirilmesine katkıda bulunabiliceğini önermektedir. TÜBİTAK-KBAG-212T031 tarafından destekelen çalışmalarımızı yayına hazırlamaktayız.17β-estradiol (E2) as the main estrogen hormone plays critical roles in physiology and pathophysiology of many tissues including breast. E2 exerts its effect by binding to transcription factor, estrogen receptor (ER). ER interactions with estrogen responsive elements (EREs) of DNA are critical for regulating gene expressions involved in cellular proliferation. Due to the centrality of E2-ER signaling in breast cancer, therapeutic modalities are centered around the reduction/ablation of circulating E2 by inhibitors of enzymes involved in E2 synthesis and/or of ER functions by E2 antagonists. However, patients eventually develop resistance to such therapies, necessitating the development of new approaches. Since ERE-driven genes are critical for cellular proliferation, the regulation of gene expressions independent of E2-ER could allow the development of therapy platforms. We therefore engineered ERE-binding protein module using ER as template. By genetically incorporating strong transactivation or transrepression domains from other transfactors into this module generated monotransactivators or monotransrepressors. We found in ERnegative cell models that monotransactivator repressed cellular proliferation by regulating gene expressions similarly to E2-ER. As expected, monotransrepressor induced cellular growth by mediating gene expressions with directions opposite to those observed with E2- ER. We published our results in August-2015 in Plos One. Ongoing studies using ERpositive cells showed that although monotransactivator regulated gene expressions similarly to E2-ER, it, unexpectedly, repressed cellular growth, contrasting to E2-ER. Whereas, monotransrepressor increased cellular growth by modulating gene expressions in opposite directions to E2-ER. Indicating that effects of monotransregulator on proliferation are dependent upon cellular-context, our results also imply that E2-ER utilizes distinct mechanisms to regulate cellular growth. Providing proof-of-concept, these studies suggest that our engineering approach are useful for the development of novel systems for biological sciences and medicine. Supported by TUBITAK-KBAG-212T031, we are preparing our findings for publication