Untersuchungen zur Regulation des intrazellulären Calciums in Physiologie und Pathophysiologie humaner und muriner Erythrozyten

Calcium übernimmt in Erythrozyten, wie auch in vielen anderen Zellen, die wichtige Rolle eines sekundären Botenstoffs. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum besseren Verständnis dieser Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie von Erythrozyten beizutragen. Daher wurden im ersten Teilprojekt dieser Arbeit Untersuchungen gemacht zum intrazellulären Ca2+-Gehalt humaner pathologischer Erythrozyten von Patienten mit seltenen hämolytischen Erkrankungen. Es konnte festgestellt werden, dass Erythrozyten von Patienten mit Hereditärer Sphärozytose, Hereditärer Xerozytose und Gardos-Channelopathie signifikant erhöhte Werte an freiem intrazellulären Calcium im Vergleich zu Erythrozyten gesunder Kontrollblutspendern aufweisen. Für die ebenfalls untersuchten Patienten mit Enzymopathien und uncharakterisierter hämolytischer Anämie wurde keine eindeutige Änderung der Ca2+-Konzentration gefunden. Zusammen mit weiteren Daten aus der Literatur deuten diese Resultate darauf hin, dass ein erhöhter intrazellulärer Ca2+-Gehalt in Erythrozyten ursächlich für den verfrühten Abbau der Zellen in hämolytischen Krankheiten ist. Dieser Mechanismus scheint allgemein gültig sein, wobei sich der Signalweg des Ca2+-Einstroms für jede Erkrankung unterscheidet. Zur Entwicklung neuer Medikamente, die auf eine Inhibition dieses Ca2+-Einstroms als bessere Therapiemöglichkeit anämischer Patienten abzielen, bedarf es jedoch weiterer Forschung. Das zweite Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Lysophosphatidsäure Signalweg, der in murinen und humanen Erythrozyten zu einem Einstrom von extrazellulärem Calcium in die Zellen führt. Diese Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts steht in Verbindung mit der Aggregation der Erythrozyten als aktiver Teil der Blutgerinnung. Der Lysophosphatidsäure Signalweg ist daher auch zur Behandlung von Thrombosen von pharmakologischem Interesse. Im Detail zeigen die an humanen und murinen Erythrozyten durchgeführten Untersuchungen zum Signalweg, dass die Aktivität des am Signalweg beteiligten TRPC6 Kanals, neben der PKCα, durch einen Komplex aus FKB12 und Calcineurin reguliert wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine zusätzliche mechanosensitive Komponente im Signalweg existiert. Ob es sich dabei um den Kanal Piezo1 handelt, muss in weiteren Untersuchungen bestätigt werden. Auf Basis des Lysophosphatidsäure Signalweges wurde im dritten Teilprojekt die Herkunft des TRPC6 Kanals in der Membran von Erythrozyten untersucht. Für humane Erythrozyten lässt sich der Kanal weder auf Proteom- noch Transkriptomebene detektieren. Auch funktionell kann TRPC6 nur in Erythrozyten, nicht in Retikulozyten nachgewiesen werden. Als Hypothese dieses Projekts wurde untersucht, ob es zu einem Transfer des Kanals von anderen Zellen auf Erythrozyten kommt. Dazu wurden Transfusionsversuche von Erythrozyten aus TRPC6 Knockout Mäusen in Wildtyp Mäuse durchgeführt. Anschließend wurde zur Beobachtung eines möglichen Proteinaustauschs der Lysophosphatidsäureinduzierte Ca2+-Einstrom in den transfundierten Erythrozyten untersucht. Als Grundlage hierfür wurden mehrere Ansätze zur Markierung von Erythrozyten vor der Transfusion getestet. Die Methode der in vivo-Biotinylierung zeigte sich nicht als geeignet zur mikroskopischen Detektion markierter Erythrozyten nach Transfusion. Eine Markierung der Zellen mittels Membranfarbstoffen als auch eine endogene Markierung der Zellen durch Expression eines Fluoreszenzproteins waren hingegen erfolgreich. Durchgeführte Transfusionsversuche auf Basis beider Methoden zeigten einen Anstieg des Lysophosphatidsäure-induzierten Ca2+-Einstroms in TRPC6-Knockout Erythrozyten nach Transfusion. Hierdurch kann auf einen Transfer des TRPC6 Kanals in die Membran der Knockout Erythrozyten von Zellen der Wildtyp Maus geschlossen werden. Der Transfer scheint dabei vermehrt oder auschließlich bei Retikulozyten vorzukommen. Eine Beteiligung der Milz an diesem Transfer wurde ebenfalls untersucht, konnte jedoch nicht belegt werden. Zum Ablauf, Ort und weiterem Verständnis des Proteintransfer müssen zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden. Ebenfalls soll die Frage geklärt werden, ob ein Austausch von Proteinen auch bei humanen roten Blutzellen auftritt.Calcium plays an important role as a second messenger, in red blood cells as well as in many other cell types. The aim of this study was to contribute to a further understanding of this role in the physiology and pathophysiology of red blood cells. In the first part of this thesis, pathologic human red blood cells from patients with rare hereditary anemias were analyzed for their intracellular calcium content. The results of this study showed that red blood cells from patients with hereditary spherocytosis, hereditary xerocytosis and Gardos channelopathy have significantly increased levels of free intracellular calcium in comparison to red blood cells from healthy donors. For patients with enzymopathies and uncharacterized hemolytic anemia there was no clear change in the intracellular calcium. Together with data from the literature, these findings indicate that an increased intracellular calcium content might be responsible for the premature elimination of red blood cells from the blood stream. This mechanism seems to have to a general scope with different pathways of calcium entry in different diseases. More research is needed for the development of drugs aiming on the inhibition of this calcium increase. The second part of this thesis deals with the lysophosphatidic acid signaling pathway, which leads to an uptake of extracellular calcium in human and murine red blood cells. This increase in intracellular calcium is associated with an aggregation of red blood cells as an active part in thrombus formation. The lysophosphatidic acid signaling pathway is therefore also an interesting pharmacological target for the treatment of thrombosis. The results of the experiments on murine and human red blood cells show, that TRPC6, a channel involved in this pathway, is regulated by PKCα and a protein complex consisting of FKB12 and calcineurin. Furthermore, the results hint to the involvement of a mechanosensitive channel in the signaling cascade. To confirm that this channel is Piezo1, further research needs to be done. Based on the lysophosphatidic acid signaling pathway, the origin of the TRPC6 channel in the membrane of red blood cells was explored in the third part of this thesis. For human red blood cells, it was not yet possible to detect the channel on a proteome- or transcriptome level. Functional evidence is also limited to mature red blood cells and missing in reticulocytes. As a hypothesis of this project, a possible transfer of the channel between red blood cells and other cell types was investigated. For this purpose, transfusion experiments of red blood cells from TRPC6 knockout mice to wildtype mice were performed. Subsequently, the lysophosphatidic acid induced calcium entry was analyzed in the transfused cells to visualize the potential transfer of the channel. Beforehand, several methods to label red blood cells for transfusion were tested. The method of in vivo biotinylation was not suitable for the microscopic detection of the cells after transfusion. Labeling the cells with membrane dyes as well as the endogenous expression of a fluorescent protein were successful. The results from the transfusion experiments based on both labeling methods showed an increase in the lysophosphatidic acid induced calcium signal in TRPC6 knockout cells after transfusion. From these results, it can be concluded that there is a transfer of the channel to the membrane of TRPC6 knockout red blood cells from cells of the wildtype mouse. This transfer seems to occur enhanced or exclusively in reticulocytes. The contribution of the spleen in this process was analyzed but could not be proven. More research is needed to resolve further questions, especially whether a transfer of proteins also occurs in human red blood cells

Progressive Splenomegalie und Makrozytose bei KCa3.1-defizienten Mäusen: Die physiologische Bedeutung des Gardos-Kanals im Erythrozyten

Der Gardos-Kanal (KCa3.1) vermittelt den Ca2+-abhängigen Ausstrom von K+ und Cl- (den Gardos-Effekt) im Erythrozyten. Hierdurch kommt es zu einer Hyperpolarisation der Zellmembran und einem osmotisch bedingten Schrumpfen der Zelle. Diesem Ca2+-aktivierten K+-Kanal wird daher eine entscheidende Rolle für die physiologische Volumenregulation in zirkulierenden Erythrozyten, sowie auch für Krankheiten mit einer pathologischen Volumenregulation zugeschrieben. Insbesondere in der Pathogenese der Sichelzellanämie nimmt der Gardos-Kanal eine zentrale Stellung ein, wodurch diesem Kanal ein besonderes Interesse zuteil wird. Hochpotente, selektive Gardos-Kanal-Inhibitoren, wie beispielsweise Senicapoc, werden aktuell in der Therapie der Sichelzellanämie evaluiert. Während die pathophysiologische Bedeutsamkeit des Gardos-Kanals in der Sichelzellanämie und anderen Erkrankungen intensiv untersucht wurde, ist die tatsächliche funktionelle Relevanz von KCa3.1 sowohl für die physiologische Volumenregulation als auch für die Mechanismen der Eryptose (in Anlehnung an die Apoptose kernhaltiger Zellen) unklar. Auch wurden die Folgen einer genetischen Störung der Expression bis dato nicht detailliert untersucht. Die vorliegende Studie erlaubt die Einordung der physiologischen Rolle. Bei einer Störung der genetischen Expression von KCa3.1 in Mäusen entwickeln diese Tiere eine progressive, moderate Splenomegalie und eine milde Makrozytose. Die Erythrozyten dieser Knock-out Mäuse weisen eine erhöhte Fragilität bei hypoosmotischem Stress im Sinne einer gestörten Volumenregulation und eine verminderte Deformierbarkeit bei der Filtration durch kleine Poren auf. Diese funktionellen Defekte führen zu einer erhöhten Sequestration in der Milz, begleitet von einer erhöhten Eisenablagerung, die hierauf mit einer Arbeitshypertrophie in Form einer stetig zunehmenden Splenomegalie reagiert. Weiterhin konnte mit dieser Studie gezeigt werden, dass der Gardos-Kanal eine zentrale Stellung in der physiologischen Volumenregulation im Erythrozyten einnimmt, die bei einem Ausfall nicht durch andere Systeme kompensiert werden kann. Anders als von anderen Autoren postuliert, konnte keine maßgebliche Rolle von KCa3.1 für die Eryptose nachgewiesen werden. Dabei stellt die vorliegende Studie die erste in vivo Studie zu diesem Themenkomplex dar

Radiomorphologische Arbeiten zur Hämochromatose-Arthropathie am Handskelett bei Patienten mit einer phänotypischen Hämochromatose

Hintergrund und Fragestellung: Die Arthropathie ist eine erst spät entdeckte Komplikation der hereditären Hämochromatose. Die Erstbeschreibung erfolgte durch Schumacher 1964. Sie ist eine der häufigsten Frühsymptome bei Hämochromatose-Patienten, weiterhin beeinflusst die Arthropathie von allen Hämochromatose-assoziierten Erkrankungen die Lebensqualität der Patienten am stärksten. Eine radiologisch dokumentierte Langzeituntersuchung findet sich in der Literatur nicht. Ziel der als retrospektiv angelegten Untersuchung war es, bei einem großen, einheitlich definierten Kollektiv den Einfluss demographischer Daten, des HFE-Genotyps, des Ausmaßes der Eisenüberladung sowie der mechanischen Belastung auf das Auftreten sowie die Ausprägung einer Arthropathie des Handskelettes zu untersuchen. An den vorhandenen radiologisch dokumentierten Langzeitverläufen sollte die Progression der radiologischen Veränderungen unter einer Aderlass- Therapie beurteilt werden. Des weiteren sollte anhand der erhobenen Daten und unter Würdigung der vorhandenen Literatur, die Theorien zur Genese der Hämochromatose- Arthropathie diskutiert, sowie eine einheitliche Definition der Arthropathie und ein Diagnose-Algorithmus erarbeitet werden. Patienten und Methodik: Es wurden 143 Patienten (98 Männer, 45 Frauen) mit nachgewiesener Eisenüberladung und erfolgter HFE- Genotypisierung auf das Vorliegen einer Hämochromatose- assoziierten Erkrankung, insbesondere einer Arthropathie untersucht. Dokumentiert und verglichen wurden demographische Daten, maximal gemessene Eisenstoffwechselparameter (Ferritin und Transferrinsättigung), der HFE- Genotyp, Angaben über die (berufliche) mechanische Belastung der Gelenke sowie Aderlassbehandlungen. Als Vergleichsgruppe sollten die Patienten mit nachgewiesener Eisenüberladung, aber ohne den Nachweis einer Arthropathie dienen. Bei Patienten mit radiologisch nachgewiesener Hämochromatose- Arthropathie wurden die vorliegenden Röntgenbilder des Handskelettes auf radiomorphologische Veränderungen sowie auf das Vorliegen eines möglichen Gelenktropismus hin untersucht und ausgewertet. Bei 16 Patienten mit radiologisch dokumentierten Langzeitverläufen wurden diese gesondert auf eine radiologische Progression hin untersucht. Ergebnisse: Bei 64 (44,8%) Patienten (52 Männer, 12 Frauen) wurde die Diagnose einer Hämochromatose- Arthropathie gestellt. Im Vergleich zu den 79 Patienten (46 Männer, 33 Frauen) ohne die Diagnose einer Arthropathie ergaben sich signifikante Unterschiede insbesonders im maximal gemessenen Ferritin, der Transferrinsättigung sowie dem Alter. In der Gruppe mit diagnostizierter Hämochromatose- Arthropathie und verfügbaren Röntgenbildern des Handskelettes (51 Patienten) konnte der in der Literatur beschriebene Gelenktropismus bezüglich des zweiten und dritten Metacarpophalangealgelenkes bestätigt werden. Es ergab sich weiterhin eine positive Korrelation zwischen der Höhe der Eisenüberladung und der Ausprägung der Arthropathie. Ein Zusammenhang zwischen mechanischer Beanspruchung und Schwere der Arthropathie konnte im Rahmen der Untersuchung, trotz wegweisender Befunde, nicht belegt werden. In den radiologisch dokumentierten Langzeitverläufen (16 Patienten) konnte unter einer bestehenden Aderlass- Therapie nur ein geringer radiologischer Progress und in keinem Fall eine neue Alteration der Metacarpophalangealgelenke dokumentiert werden. Es wurde weiterhin aufgrund der erhobenen Ergebnisse und unter Würdigung der vorhandene Literatur der Entwurf für eine einheitliche Definition der Hämochromatose- Arthropathie und ein Diagnose-Algorithmus erarbeitet. Fazit: Die Bedeutung der Eisenüberladung für die Entstehung sowie die Ausprägung der Hämochromatose- Arthropathie konnte nachgewiesen werden. Des weiteren konnte ein nur geringem Progress der radiologischen Veränderungen im Langzeitverlauf und ein Fehlen einer neuen Alterationen der Metacarpophalangealgelenke unter fortlaufender Eisendepletion nachgewiesen werden. Die in der Literatur dargestellte therapeutische Ineffektivität einer Aderlass-Therapie auf den Progress einer Hämochromatose-Arthropathie konnte somit nicht bestätigt werden. Die frühzeitige und konsequente Aderlass-Therapie stellt die Quintessenz der oben dargestellten Ergebnisse bezüglich einer Therapieoption zur Verhinderung oder Konsolidierung einer Hämochromatose-Arthropathie dar.Arthropathy is a recently discovered complication of hereditary hemochromatosis. It was first described by Schumacher in 1964 and is one of the most frequent early symptoms in hemochromatosis patients. Of all hemochromatosis-associated symptoms, arthropathy has the highest negative impact on a patient's quality of life. The aim of this retrospective study was to show possible correlations between demographic factors, the HFE-genotype, the level of iron-overload as well as the mechanic burden of manual labor on the manifestation and extent of an arthropathy of the hand skeleton. Based on long-term radiologic data, the progression of radiologic change in the hand skeleton of patients receiving phlebotomy treatment was to be determined. Theories on the pathogenesis of hemochromatosis-arthropathy were to be reviewed and a standard definition of hemochromatosis-arthropathy including a diagnostic algorithm were to be developed. Material and methods: 143 HFE-genotyped patients (98 male, 45 female) with a proven iron-overload were screened for hemochromatosis-associated diseases, especially arthropathy. Demographic data, the maximum ferritin- and transferrin-saturation, the HFE-genotype, administered phlebotomies and details of the mechanical burden on the joints were documented and compared. Patients with a proven iron-overload but without manifestations of an arthropathy served as a reference group. In patients with a proven hemochromatosis-arthropathy, X-rays of the hand skeleton were screened for radiomorphologic changes as well as possible joint tropism. 16 patients with long-term radiologic documentation were selectively screened for radiologic progression. Results: 64 (44,8% ) patients (52 male, 12 female) were diagnosed as having a hemochromatosisarthropathy. When compared to the 79 patients (46 male, 33 female) without an arthropathy, there were significant differences in the maximum measured ferritin, transferrin-saturation and age. In the group of patients with a proven hemochromatosis-arthropathy and available Xrays of the hand skeleton (51 patients), the joint tropism of the second and third metacarpophalangeal joint described in the literature was confirmed. Furthermore, there was a positive correlation between the level of iron-overload and the extent of the arthropathy. There was no correlation between the mechanical burden on the joints and the extent of the arthropathy. The 16 patients with long-term radiologic documentation (undergoing phlebotomy therapy) showed only slow radiologic progression, and in no case could recent changes in the metacarpophalangeal joint be found. With the help of the results of this study and the literature, a standard definition of hemochromatosis-arthropathy and a diagnostic algorithm were developed. Discussion: In this study, the importance of iron-overload in the manifestation and extent of hemochromatosis-arthropathy was shown. Furthermore, in patients undergoing phlebotomy therapy, only a slow progression of radiologic changes in the long term and no recent changes in the metacarpophalangeal joints were found. So the therapeutic ineffectiveness of phlebotomy therapy in slowing the progression of a hemochromatosis-arthropathy, as postulated in the literature, could not be confirmed. Early onset and consistent implementation of phlebotomy therapy represents a viable option to prevent or stop the progression of hemochromatosis-arthropathy

Beurteilung der maschinellen Parameter der Retikulozytenanalytik des Sysmex XT-2000iV bei Katzen

Das Ziel dieser Dissertation bestand darin, die Parameter der Retikulozytenanalytik des Sysmex XT-2000iV bei Katzen zu beurteilen. Hierbei wurden die Retikulozytenwerte und die Retikulozytenparameter des Sysmex mit der entsprechenden manuellen Retikulozytenzählung anämischer Katzen verglichen und ein besonderes Augenmerk auf die Übereinstimmung der Anämieklassifizierung in regenerativ und aregenerativ gelegt. Desweiteren wurden gerätespezifische Wertebereiche für die maschinellen Parameter der Retikulozytenanalytik einer repräsentativen nicht anämischen Klinikpopulation ermittelt und die Prävalenz sowie mögliche Ätiopathogenesen einer Retikulozytose ohne Anämie untersucht. Für den Methodenvergleich wurden Retikulozyten von 50 anämischen Katzen manuell ausgezählt und mit den maschinellen Werten anhand einer Bland-Altman Analyse und einer Passing-Bablok Regression verglichen. Um die Präzision des Sysmex  zu bestimmen, wurden 20 Doppelmessungen durchgeführt. Die Übereinstimmung der diagnostischen Aussagekraft zwischen der maschinellen und manuellen Retikulozytenzählung in Hinblick auf eine regenerative oder aregenerative Anämie wurde mithilfe des Cohen’s Kappa Koeffizienten (κ) aufgezeigt. Die diagnostische Aussagekraft der Immaturen Retikulozytenfraktion (IRF) für eine Klassifizierung in regenerative oder aregenerative Anämie wurde mithilfe von Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Kurven aufgezeigt. Die beste Übereinstimmung wurde zwischen der maschinellen Retikulozytenzählung und den aggregierten Retikulozyten mit einem Bias von + 21,45 x 109/l gefunden. Trotz des positiven Bias zeigte der κ von 0,69 eine gute Übereinstimmung. Hierbei wurde für die Retikulozyten ein Cut-Off-Wert von > 40 x 109/l für das Aufzeigen einer Regeneration gewählt. Durch die Erhöhung des für den Sysmex angewandten Cut-Off-Wertes entsprechend des Bias auf > 61 x 109/l, wurde eine deutlich bessere Übereinstimmung (κ = 0,88) ermittelt. Es konnte mittels ROC-Kurve gezeigt werden, dass die IRF (%) bei einem Cut-Off-Wert von 13,7 % die beste Sensitivität und Spezifität (85,0 %; 76,7 %) aufwies, um die Anämie in regenerativ und aregenerativ zu klassifizieren. Die Verwendung absoluter Werte der IRF übertraf bei einem Cut-Off-Wert von 5,69 x 109/l die Sensitivität und Spezifität (90,0 %; 96,7 %) des relativen Wertes der IRF. Die Präzision der maschinellen Retikulozytenzählung hatte mit einem moderaten Wert von 10,3 % einen besseren Variationskoeffizienten als die manuelle Retikulozytenzählung in vergleichbaren Studien. Aus einer repräsentativen felinen Klinikpopulation (n = 2197) wurden 165 Blutproben nicht anämischer Katzen selektiert, um gerätespezifische Wertebereiche der Parameter der Retikulozytenanalytik zu ermitteln. Die Prävalenz einer Retikulozytose ohne Anämie wurde bestimmt und die Klinikhistorie der entsprechenden Katzen recherchiert. Vergleicht man die Referenzintervalle des Sysmex XT-2000iV von Granats Studie mit den hier ermittelten Wertebereichen nicht anämischer Katzen, so lassen sich deutliche Parallelen erkennen. Die Retikulozytenzahlen, die von Sysmex XT-2000iV gemessen werden, sind höher als die anderer Hämatologie-Analysegeräte. Die Prävalenz einer Retikulozytose bei nicht anämischen Katzen betrug 3,2 % (70/2197). Potentiell prädisponierende intrinsische und extrinsische Faktoren für eine gesteigerte Erythropoese lagen insbesondere bei folgender feliner Krankheitsklassifizierung dieser 70 Katzen (86 Diagnosen) vor: neoplastisch (14/86; 16,3 %), neoplastisch versus inflammatorisch (9/86; 10,5 %), endokrin (9/86; 10,5 %), dermatologisch (8/86; 9,3 %), kardiologisch / respiratorisch (8/86; 9,3 %), urologisch (7/86; 8,1 %), traumatisch (5/86; 5,8 %), gastrointestinal (5/86; 5,8 %), neurologisch (4/86; 4,7 %), hepatisch (3/86; 3,5 %), gynäkologisch (2/86; 2,3 %), orthopädisch (1/86; 1,2 %), sonstige (4/86; 4,7 %), keine Krankheitsdiagnose (7/86; 8,1 %). Die maschinelle Retikulozytenzählung stimmt am besten mit der manuellen Auszählung aggregierter Retikulozyten bei anämischen Katzen überein. Die IRF ist neben der maschinellen Retikulozytenzählung ein geeigneter Parameter um die Anämie in regenerativ und aregenerativ zu klassifizieren. Weitere Studien werden benötigt, um die Relevanz der IRF hinsichtlich Anämie verursachender Erkrankungen zu evaluieren. Solange keine Standardisierung und Kalibrierung der Hämatologie-Analysegeräte vorliegt, ist eine gerätespezifische Beurteilung der Parameter der Retikulozytenanalytik empfehlenswert. Tritt bei nicht anämischen oder gesunden Katzen eine Retikulozytose auf, dienen die genannten potentiell prädisponierenden Faktoren als Orientierung für die weitere diagnostische Aufarbeitung

Beurteilung der maschinellen Parameter der Retikulozytenanalytik des Sysmex XT-2000iV bei Katzen

Das Ziel dieser Dissertation bestand darin, die Parameter der Retikulozytenanalytik des Sysmex XT-2000iV bei Katzen zu beurteilen. Hierbei wurden die Retikulozytenwerte und die Retikulozytenparameter des Sysmex mit der entsprechenden manuellen Retikulozytenzählung anämischer Katzen verglichen und ein besonderes Augenmerk auf die Übereinstimmung der Anämieklassifizierung in regenerativ und aregenerativ gelegt. Desweiteren wurden gerätespezifische Wertebereiche für die maschinellen Parameter der Retikulozytenanalytik einer repräsentativen nicht anämischen Klinikpopulation ermittelt und die Prävalenz sowie mögliche Ätiopathogenesen einer Retikulozytose ohne Anämie untersucht. Für den Methodenvergleich wurden Retikulozyten von 50 anämischen Katzen manuell ausgezählt und mit den maschinellen Werten anhand einer Bland-Altman Analyse und einer Passing-Bablok Regression verglichen. Um die Präzision des Sysmex  zu bestimmen, wurden 20 Doppelmessungen durchgeführt. Die Übereinstimmung der diagnostischen Aussagekraft zwischen der maschinellen und manuellen Retikulozytenzählung in Hinblick auf eine regenerative oder aregenerative Anämie wurde mithilfe des Cohen’s Kappa Koeffizienten (κ) aufgezeigt. Die diagnostische Aussagekraft der Immaturen Retikulozytenfraktion (IRF) für eine Klassifizierung in regenerative oder aregenerative Anämie wurde mithilfe von Receiver-Operating-Characteristic (ROC)-Kurven aufgezeigt. Die beste Übereinstimmung wurde zwischen der maschinellen Retikulozytenzählung und den aggregierten Retikulozyten mit einem Bias von + 21,45 x 109/l gefunden. Trotz des positiven Bias zeigte der κ von 0,69 eine gute Übereinstimmung. Hierbei wurde für die Retikulozyten ein Cut-Off-Wert von > 40 x 109/l für das Aufzeigen einer Regeneration gewählt. Durch die Erhöhung des für den Sysmex angewandten Cut-Off-Wertes entsprechend des Bias auf > 61 x 109/l, wurde eine deutlich bessere Übereinstimmung (κ = 0,88) ermittelt. Es konnte mittels ROC-Kurve gezeigt werden, dass die IRF (%) bei einem Cut-Off-Wert von 13,7 % die beste Sensitivität und Spezifität (85,0 %; 76,7 %) aufwies, um die Anämie in regenerativ und aregenerativ zu klassifizieren. Die Verwendung absoluter Werte der IRF übertraf bei einem Cut-Off-Wert von 5,69 x 109/l die Sensitivität und Spezifität (90,0 %; 96,7 %) des relativen Wertes der IRF. Die Präzision der maschinellen Retikulozytenzählung hatte mit einem moderaten Wert von 10,3 % einen besseren Variationskoeffizienten als die manuelle Retikulozytenzählung in vergleichbaren Studien. Aus einer repräsentativen felinen Klinikpopulation (n = 2197) wurden 165 Blutproben nicht anämischer Katzen selektiert, um gerätespezifische Wertebereiche der Parameter der Retikulozytenanalytik zu ermitteln. Die Prävalenz einer Retikulozytose ohne Anämie wurde bestimmt und die Klinikhistorie der entsprechenden Katzen recherchiert. Vergleicht man die Referenzintervalle des Sysmex XT-2000iV von Granats Studie mit den hier ermittelten Wertebereichen nicht anämischer Katzen, so lassen sich deutliche Parallelen erkennen. Die Retikulozytenzahlen, die von Sysmex XT-2000iV gemessen werden, sind höher als die anderer Hämatologie-Analysegeräte. Die Prävalenz einer Retikulozytose bei nicht anämischen Katzen betrug 3,2 % (70/2197). Potentiell prädisponierende intrinsische und extrinsische Faktoren für eine gesteigerte Erythropoese lagen insbesondere bei folgender feliner Krankheitsklassifizierung dieser 70 Katzen (86 Diagnosen) vor: neoplastisch (14/86; 16,3 %), neoplastisch versus inflammatorisch (9/86; 10,5 %), endokrin (9/86; 10,5 %), dermatologisch (8/86; 9,3 %), kardiologisch / respiratorisch (8/86; 9,3 %), urologisch (7/86; 8,1 %), traumatisch (5/86; 5,8 %), gastrointestinal (5/86; 5,8 %), neurologisch (4/86; 4,7 %), hepatisch (3/86; 3,5 %), gynäkologisch (2/86; 2,3 %), orthopädisch (1/86; 1,2 %), sonstige (4/86; 4,7 %), keine Krankheitsdiagnose (7/86; 8,1 %). Die maschinelle Retikulozytenzählung stimmt am besten mit der manuellen Auszählung aggregierter Retikulozyten bei anämischen Katzen überein. Die IRF ist neben der maschinellen Retikulozytenzählung ein geeigneter Parameter um die Anämie in regenerativ und aregenerativ zu klassifizieren. Weitere Studien werden benötigt, um die Relevanz der IRF hinsichtlich Anämie verursachender Erkrankungen zu evaluieren. Solange keine Standardisierung und Kalibrierung der Hämatologie-Analysegeräte vorliegt, ist eine gerätespezifische Beurteilung der Parameter der Retikulozytenanalytik empfehlenswert. Tritt bei nicht anämischen oder gesunden Katzen eine Retikulozytose auf, dienen die genannten potentiell prädisponierenden Faktoren als Orientierung für die weitere diagnostische Aufarbeitung