Produção e caracterização de anticorpos monoclonais anti-gp51 do vírus Leucose Bovina (VLB)

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 10/09/2009Bibliografia: fls. 90-94Área de concentração: Saúde Animal e HumanaResumo: O objetivo do presente trabalho foi produzir e caracterizar anticorpos monoclonais (AcMc) contra proteína gp51 para insumo de diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina. Foram utilizadas duas preparações do antígeno para imunização em camundongos BALB/c, a partícula viral in natura e o vírus lisado. Estas preparações foram selecionadas para obtenção de anticorpos monoclonais específicos para proteínas da partícula viral e proteínas virais intracelulares do VLB, respectivamente. Os animais foram imunizados por via intraperitonial devido a toxicidade causada pelo tampão de lise em outras vias de noculação. A fusão realizada originou 274 colônias de hibridomas, sendo 18 hibridomas positivos em ELISA indireto e nove fraco positivo, inicialmente descartados. O teste de estabilidade de secreção de anticorpos permitiu selecionar 10 hibridomas, que foram caracterizados pela rea ividade em Western Blotting, para proteína gp51 (dez AcMc), e por isotipagem em IgG1 (um AcMc); IgM (nove AcMc). Todos os AcMc foram produzidos para gp51 comprovando ser a proteína do VLB mais imunogênica e acessível, presente em diferentes preparações antigênicas. A produção de AcMc ascítico mostrou aumento qualitativo e quantitativo de secreção de anticorpos, quando comparado aos AcMc que não foram submetidos ao líquido ascítico.Abstract: The objective of this work was to produce and characterize monoclonal antibodies (mAbs) against the protein gp51 for a diagnosis input of the Bovine Enzootic Leukosis. Two different preparations of the antigen for immunizing BALB/c mice were used, in natura viral particle and lysate virus. These preparations were selected to obtain specific monoclonal antibodies for the viral particle protein and BLV intracellular viral proteins, respectively. The animals were immunized through intraperitoneal way due to the toxicity caused by the lysis buffer in other ways of inoculation. The fusion originated 274 hybridoma colonies, from which 18 hybridomas were positive on indirect ELISA and nine were weak positive, initially discarded. The stability test of antibodies secretion, 10 hybridomas were selected, characterized by the Western Blotting reactivity, for the protein gp51 (ten mAbs) and by isotyping IgG1 (one mAb); IgM (nine mAbs). All mAbs were produced for gp51 proving to be the BLV most immunogenic and accessible protein present in different antigenic preparations. The production of ascitis mAbs has shown a qualitative and quantitative improvement of the mAbs secretion when compared with the (mAbs) were not subject to ascites fluid

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais anti-gp51 do vírus Leucose Bovina (VLB)

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 10/09/2009Bibliografia: fls. 90-94Área de concentração: Saúde Animal e HumanaResumo: O objetivo do presente trabalho foi produzir e caracterizar anticorpos monoclonais (AcMc) contra proteína gp51 para insumo de diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina. Foram utilizadas duas preparações do antígeno para imunização em camundongos BALB/c, a partícula viral in natura e o vírus lisado. Estas preparações foram selecionadas para obtenção de anticorpos monoclonais específicos para proteínas da partícula viral e proteínas virais intracelulares do VLB, respectivamente. Os animais foram imunizados por via intraperitonial devido a toxicidade causada pelo tampão de lise em outras vias de noculação. A fusão realizada originou 274 colônias de hibridomas, sendo 18 hibridomas positivos em ELISA indireto e nove fraco positivo, inicialmente descartados. O teste de estabilidade de secreção de anticorpos permitiu selecionar 10 hibridomas, que foram caracterizados pela rea ividade em Western Blotting, para proteína gp51 (dez AcMc), e por isotipagem em IgG1 (um AcMc); IgM (nove AcMc). Todos os AcMc foram produzidos para gp51 comprovando ser a proteína do VLB mais imunogênica e acessível, presente em diferentes preparações antigênicas. A produção de AcMc ascítico mostrou aumento qualitativo e quantitativo de secreção de anticorpos, quando comparado aos AcMc que não foram submetidos ao líquido ascítico.Abstract: The objective of this work was to produce and characterize monoclonal antibodies (mAbs) against the protein gp51 for a diagnosis input of the Bovine Enzootic Leukosis. Two different preparations of the antigen for immunizing BALB/c mice were used, in natura viral particle and lysate virus. These preparations were selected to obtain specific monoclonal antibodies for the viral particle protein and BLV intracellular viral proteins, respectively. The animals were immunized through intraperitoneal way due to the toxicity caused by the lysis buffer in other ways of inoculation. The fusion originated 274 hybridoma colonies, from which 18 hybridomas were positive on indirect ELISA and nine were weak positive, initially discarded. The stability test of antibodies secretion, 10 hybridomas were selected, characterized by the Western Blotting reactivity, for the protein gp51 (ten mAbs) and by isotyping IgG1 (one mAb); IgM (nine mAbs). All mAbs were produced for gp51 proving to be the BLV most immunogenic and accessible protein present in different antigenic preparations. The production of ascitis mAbs has shown a qualitative and quantitative improvement of the mAbs secretion when compared with the (mAbs) were not subject to ascites fluid

Production and characterization of monoclonal antibodies anti fragment Fc of bovine IgG

The aim of this work was to produce and characterize monoclonal antibodies anti bovine immunoglobulin G (IgG). Out of seven hybridomas, two were chosen based on the ELISA'S absorbance values and were labeled B4F11 and B3H12. These monoclonals were analyzed through Western Blot for IgG fragments obtained by proteolysis with papain, separated by electrophoresis in polyacrylamide gel electrophoresis with β-mercaptoetanol as reducing agent. This revealed that, possibly, the B4F11 was directed to a conformational antigen, and that B3H12 reacted in a specific fashion with Fc (Bovine IgG crystallizable fragment). This antibody could be used in the development of reagents to immunoassays relevant for research and diagnosis.No Brasil, anticorpos anti-espécie específica usados em métodos de diagnóstico geralmente são importados, aumentando o custo das análises. Visando produzir insumos para métodos diagnóstico por enzimaimunoensaio, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar anticorpos monoclonais anti imunoglobulina G (IgG) bovina. De sete hibridomas obtidos e que apresentaram valores relevantes de absorbância em teste imunoenzimático (ELISA indireta), dois clones com melhor performance foram selecionados e designados B4F11 e B3H12. Estes anticorpos monoclonais foram analisados em Western Blot para reatividade com fragmentos de IgG bovina, obtidos por proteólise com papaína e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, com presença do agente redutor beta-mercaptoetanol. A eletroforese mostrou que o anticorpo B4F11, foi direcionado para um antígeno conformacional, e que o monoclonal B3H12 reagiu especificamente com a porção Fc da IgG bovina (fragmento cristalizável). Este anticorpo será utilizado no desenvolvimento de reagentes para imunoensaios de interesse à pesquisa e diagnósticos

Production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and standardization of direct immunofluorescence for detecting oocysts in water

INTRODUCTION: The production of anti-Cryptosporidium polyclonal antibodies and its use in direct immunofluorescence assays to determine the presence of Cryptosporidium in water are described in the present work. METHODS: Two rabbits were immunized with soluble and particulate antigens from purified Cryptosporidium oocysts. The sera produced were prepared for immunoglobulin G extraction, which were then purified and conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC). Slides containing known amounts of oocysts were prepared to determine the sensitivity of the technique. To test the specificity, slides containing Giardia duodenalis cysts were prepared. RESULTS: The conjugate was successfully used in water samples experimentally contaminated with Cryptosporidium oocysts, and it was possible to detect up to five oocysts/spot, corresponding to contamination of 250 oocysts/mL. CONCLUSIONS: The three immunizations performed in the rabbits were enough to produce antibodies against Cryptosporidium, the standard direct immunofluorescence assay permitted the detection of five oocysts in 20% of the samples, and no cross-reaction with Giardia duodenalis cysts occurred