Bases moleculares e implicancia de la hipermutabilidad en la conversión y reversión a fenotipos adaptados al biofilm en pseudomonas aeruginosa

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017La mutagénesis es uno de los mecanismos esenciales involucrados en la generación de variabilidad genética y en la adquisición de fenotipos adaptativos en bacterias. En este sentido, frente a cambios ambientales repentinos o en la colonización de nuevos nichos ecológicos, un incremento en la tasa de mutación aumenta la probabilidad de adquirir aquellos fenotipos beneficiosos, constituyendo de esta manera una estrategia clave para la adaptación. Particularmente, las infecciones pulmonares crónicas causadas por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) exhiben una alta prevalencia de cepas con una tasa de mutación espontánea incrementada, denominadas hipermutadoras, fundamentalmente asociada a la emergencia de mutantes deficientes en el sistema de reparación de bases apareadas incorrectamente (MRS). En este contexto, P. aeruginosa se desarrolla en las vías aéreas del pulmón FQ en un estilo de vida denominado biofilm, en donde las bacterias crecen adheridas a la mucosa respiratoria a través de una matríz de exopolisacáridos por ellas producida y exhiben características morfológicas y metabólicas diferentes a las expresadas durante el crecimiento planctónico. Este estilo de vida está asociado a un proceso de diversificación que implica la emergencia, selección y fijación de múltiples variantes fenotípicas a través de la adquisición de mutaciones beneficiosas. En contrapartida, durante la etapa de dispersión del biofilm, la cual consiste en el desprendimiento de las células desde el biofilm maduro, se produce una reversión de parte de estos rasgos adaptativos y las células vuelven a un estadío de vida planctónico, brindando la posibilidad de colonizar nuevos nichos y propagar la infección. Así, los procesos de formación y dispersión de biofilms suponen la emergencia y reversión de morfotipos específicamente adaptados. Debido a que ambos fenómenos estarían basados en mecanismos mutagénicos, un incremento en la tasa de mutación podría resultar beneficioso y favorecer el proceso completo. Dentro de este marco teórico, el objetivo principal de este estudio consistió en estudiar la flexibilidad de P. aeruginosa para diversificar y revertir en forma sucesiva a fenotipos característicos del crecimiento en biofilms y al mismo tiempo estudiar cuál es la implicancia de la hipermutabilidad en dicho proceso. Para ello, se utilizó como modelo al fenotipo de colonias pequeñas (SCV) de P. aeruginosa, uno de los morfotipos adaptados e hiperproductores de biofilms, el cual fue ensayado en cuanto a su emergencia y reversión en un ensayo de evolución in vitro experimental. Este ensayo fue realizado de manera repetida y sucesiva, analizando en paralelo líneas evolutivas independientemente fundadas a partir de un ancestro normomutador e hipermutador común. Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad en la conversión y reversión sucesiva al fenotipo SCV se encuentra favorecida ante un aumento en la tasa de mutación. En este sentido, el proceso de diversificación fenotípica así como el valor de frecuencia de reversión del fenotipo SCV fueron notablemente mayores en cepas hipermutadoras respecto a la cepa normomutadora, incluso cuando las propiedades fenotípicas de las SCV y sus respectivas variantes revertidas y ancestrales fueron similares. Mediante análisis de genómica estructural comparativa, se determinó que la base molecular que subyace al proceso de conversión/reversión SCV consiste en la regulación de los niveles intracelulares del segundo mensajero c-di-GMP, existiendo un marcado paralelismo evolutivo y una fuerte selección positiva, tanto en las líneas WT como en las hipermutadoras, para la mutagénesis de los sistemas de transducción wsp e yfi. En todos los casos, las mutaciones en estos sistemas se adquieren de un modo compensatorio, determinando el incremento y la disminución de los niveles de c-di-GMP en cada ciclo de conversión y reversión, respectivamente. Interesantemente, a medida que los ciclos evolutivos avanzan las líneas normomutadoras muestran a partir del ciclo 5 de evolución una fuerte restricción genética, evidenciada como una caída significativa en la frecuencia de conversión SCV. Esta restricción no fue observada para las líneas hipermutadoras, las cuales evolucionaron hasta el ciclo de evolución 16 inclusive. A partir del ciclo 5 de evolución, estas líneas muestran la adquisición de mutaciones en otras enzimas y reguladores involucrados en el metabolismo del c-di-GMP, las cuales no serían suficientes para adaptarse al esquema impuesto sosteniendo puramente un mecanismo de mutaciones compensatorias. La presencia de mutaciones de tipo inserción/deleción en secuencias repetidas pequeñas (SSR) de G:C en algunos genes implicados en la regulación de los niveles de este segundo mensajero, abren la posibilidad de que la mayor flexibilidad y adaptabilidad de las líneas hipermutadoras se base a su vez en un mecanismo de conversión y reversión de una misma mutación (“switch on/off mutations”), el que, a manera de un interruptor genético, permitiría la variación fenotípica de manera indefinida. El presente trabajo constituye un importante aporte para el conocimiento de la implicancia de la hipermutabilidad, por deficiencia en el MRS, en la adaptabilidad de P. aeruginosa, la cual subyace la notable versatilidad que esta especie bacteriana despliega para prosperar en un sin número de ambientes diferentes y, como patógeno oportunista, persistir en las vías aéreas de pacientes con FQ a lo largo de la vida del paciente sin poder ser erradicada por ninguna terapia hasta el momento conocida.Fil: Tobares, Romina Alín. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Fil: Smania, Andrea María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Fil. Smania, Andrea María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Fil: Sotomayor, Claudia Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.Fil: Sotomayor, Claudia Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Fil: Becerra, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas; Argentina.Fil: Becerra, María Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina.Fil: Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.Fil: Bocco, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Fil: Studdert, Claudia Alicia. Universidad Nacional del Litoral; Argentina.Fil: Studdert, Claudia Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina

Hypermutator pseudomonas aeruginosa exploits multiple genetic pathways to develop multidrug resistance during long-term infections in the airways of cystic fibrosis patients

Pseudomonas aeruginosa exploits intrinsic and acquired resistance mechanisms to resist almost every antibiotic used in chemotherapy. Antimicrobial resistance in P. aeruginosa isolates recovered from cystic fibrosis (CF) patients is further enhanced by the occurrence of hypermutator strains, a hallmark of chronic infections in CF patients. However, the within-patient genetic diversity of P. aeruginosa populations related to antibiotic resistance remains unexplored. Here, we show the evolution of the mutational resistome profile of a P. aeruginosa hypermutator lineage by performing longitudinal and transversal analyses of isolates collected from a CF patient throughout 20 years of chronic infection. Our results show the accumulation of thousands of mutations, with an overall evolutionary history characterized by purifying selection. However, mutations in antibiotic resistance genes appear to have been positively selected, driven by antibiotic treatment. Antibiotic resistance increased as infection progressed toward the establishment of a population constituted by genotypically diversified coexisting sublineages, all of which converged to multidrug resistance. These sublineages emerged by parallel evolution through distinct evolutionary pathways, which affected genes of the same functional categories. Interestingly, ampC and ftsI, encoding the β-lactamase and penicillin-binding protein 3, respectively, were found to be among the most frequently mutated genes. In fact, both genes were targeted by multiple independent mutational events, which led to a wide diversity of coexisting alleles underlying β-lactam resistance. Our findings indicate that hypermutators, apart from boosting antibiotic resistance evolution by simultaneously targeting several genes, favor the emergence of adaptive innovative alleles by clustering beneficial/compensatory mutations in the same gene, hence expanding P. aeruginosa strategies for persistence.Fil: Colque, Claudia Antonella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Albarracín Orio, Andrea Georgina. Universidad Católica de Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J.; ArgentinaFil: Feliziani, S.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Marvig, R. L.. Rigshospitalet. Center for Genomic Medicine; DinamarcaFil: Tobares, Romina Alín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Johansen, H.K.. Department Of Clinical Microbiology, Rigshospitalet; Dinamarca. University Of Copenhagen. Faculty Of Health And Medical Sciences.; DinamarcaFil: Molin, S.. Technical University of Denmark; DinamarcaFil: Smania, Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Fungal-bacterial interaction selects for quorum sensing mutants with increased production of natural antifungal compounds

Soil microorganisms coexist and interact showing antagonistic or mutualistic behaviors. Here we show that an environmental strain of Bacillus subtilis undergoes heritable phenotypic variation upon interaction with the soil fungal pathogen Setophoma terrestris (ST). Metabolomics analysis revealed differential profiles in B. subtilis before (pre-ST) and after (post-ST) interacting with the fungus, which paradoxically involved the absence of lipopeptides surfactin and plipastatin and yet acquisition of antifungal activity in post-ST variants. The profile of volatile compounds showed that 2-heptanone and 2-octanone were the most discriminating metabolites present at higher concentrations in post-ST during the interaction process. Both ketones showed strong antifungal activity, which was lost with the addition of exogenous surfactin. Whole-genome analyses indicate that mutations in ComQPXA quorum-sensing system, constituted the genetic bases of post-ST conversion, which rewired B. subtilis metabolism towards the depletion of surfactins and the production of antifungal compounds during its antagonistic interaction with S. terrestris.Fil: Albarracín Orio, Andrea Georgina. Universidad Católica de Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J.; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Petras, Daniel. University of California at San Diego. Skaggs School of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. Collaborative Mass Spectrometry Innovation Center; Estados Unidos. University of California at San Diego. Scripps Institution of Oceanography; Estados UnidosFil: Tobares, Romina Alín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Aksenov, Alexander. University of California at San Diego. Skaggs School of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. Collaborative Mass Spectrometry Innovation Center; Estados Unidos. University of California at San Diego. Scripps Institution of Oceanography; Estados UnidosFil: Wang, Mingxun. University of California at San Diego. Skaggs School of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. Collaborative Mass Spectrometry Innovation Center; Estados UnidosFil: Juncosa, Florencia. Universidad Católica de Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J.; ArgentinaFil: Sayago, Pamela María del Luján. Universidad Católica de Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sanchez Labrador S. J.; ArgentinaFil: Moyano, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Dorrestein, Pieter. University of California at San Diego. Skaggs School of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. Collaborative Mass Spectrometry Innovation Center; Estados UnidosFil: Smania, Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentin

Draft genome sequence of Bacillus subtilis ALBA01, a strain with antagonistic activity against the soilborne fungal pathogen of onion Setophoma terrestris

Bacillus subtilis is a nonpathogenic bacterium that lives in soil and has long been used as biological control agent in agriculture. Here, we report the genome sequence of a B. subtilis strain isolated from rhizosphere of onion that shows strong biological activity against the soilborne fungal pathogen Setophoma terrestris.Fil: Albarracín Orio, Andrea Georgina. Universidad Católica de Córdoba. Facultad de Ciencias Agropecuarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Tobares, Romina Alín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ducasse, Daniel Adrián. Universidad Católica de Córdoba. Facultad de Ciencias Agropecuarias; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones Agropecuarias; ArgentinaFil: Smania, Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin