"Untersuchungen zur biologischen Funktion des trankriptionellen Repressors E2F6"

E2F Transkriptionsfaktoren sind zentrale Regulatoren der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. E2F Proteine binden über eine konservierte DNA Bindedomäne an DNA Motiv der Sequenz (T(c/g)CCGC(c/g). Dieses Konsensusmotiv konnte in den Promotoren zahlreicher Gene nachgewiesen werden. Der E2F Familie werden derzeit sieben Proteine zugeordnet (E2F1-E2F7). E2F1-E2F5 sind transkriptionelle Aktivatoren. Ihre transaktivierende Wirkung wird durch die zellzyklusabhängige Bindung an Pocket Proteine (pRb, p107, p130) negativ reguliert. E2F1-E2F5 zeigen eine sowohl spezifische als auch überlappende Funktionen in der Zellzyklusregulation und in der Embryonalentwicklung. Dagegen bilden E2F6 und E2F7 transkriptionelle Repressoren, die nicht an Pocket Proteine binden. Ihre physiologische Funktionen sind unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die in-vivo Funktion von E2F6 analysiert werden. Hierzu wurden E2F6 defiziente Mäuse charakterisiert, die in Vorarbeiten durch Dr. Stefan Gaubatz hergestellt und zur Verfügung gestellt wurden. E2F6 defiziente Mäuse sind lebensfähig, gesund und fruchtbar. E2f6-/- Fibroblasten proliferieren normal und zeigen eine zu den Kontrollzellen identische Zellzyklusverteilung. E2F6 defiziente Fibroblasten arretieren reversibel in der G0 Phase des Zellzyklus. Außerdem induzieren sie eine normale replikative und onkogene Seneszenz. Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass E2F6 nicht für die Zellzyklusregulation benötigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei gewebespezifische Phänotypen E2F6 defizienter Mäuse beobachtet werden: Zum einen wurde ein Defekt in der Spermatogenese E2F6 defizienter Männchen festgestellt, dessen molekulare Ursache jedoch unklar ist. Dieser Defekt beeinträchtigt nicht die Fruchtbarkeit von E2f6-/- Mäusen. Zum anderen konnten posteriore homeotische Transformationen entlang der antero-posterioren Achse von Skeletten E2F6 defizienter Mäuse identifiziert werden. Diese ähneln auffällig den Skelettphänotypen Polycomb Protein defizienter Mäuse. Da vorangegangene Studien eine Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen zeigten, konnte durch den in dieser Arbeit beobachteten E2f6-/- Phänotyp erstmals in-vivo Evidenz für einen funktionelle Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen erhalten werden. Polycomb Proteine inhibieren die Expression von Hox Genen. Es kann daher spekuliert werden, dass E2F6 Polycomb Proteine an die Promotoren von Hox Gene rekrutiert. Im Gegensatz zu den Polycomb defizienten Mäusen konnte allerdings in ersten Untersuchungen keine deregulierte Expression spezifischer Hox Gene in 9.5 Tage alten E2f6-/- Embryonen nachgewiesen werden. Unter Verwendung eines cDNA Microarrays konnten die meiotischen Kohäsine Smc1l2 (Structural Maintenance of Chromosomes 1l2) und Stag3 (Stromal Antigen 3), sowie das noch nicht charakterisierte Gen XM_196054 als E2F6 regulierte Gene identifiziert und mit verschiedenen experimentellen Ansätzen bestätigt werden. Durch den Nachweis von E2F6 auf dem endogenen Promotor von Stag3 kann eine direkte Regulation von Stag3 durch E2F6 angenommen werden. Weiterhin konnte eine E2F Konsensussequenz im Stag3 und Smc1l2 Promotor identifiziert werden, die eine Bindung von E2F6 ermöglicht und für eine Repression benötigt wird. Anhand dieser Gene wurde in dieser Arbeit der E2F6 vermittelte Repressionsmechanismus untersucht: Dabei konnte beobachtet werden, dass Histon H3 des Smc1l2 und Stag3 Promotors in E2f6+/+, nicht jedoch in E2f6-/- Fibroblasten an H3 Lysin 9 (K9) dimethyliert und am Lysin 27 (K27) trimethyliert ist. Diese Methylierungen korrelieren mit der Repression der Stag3 und Smc1l2 Expression in E2f6+/+ Fibroblasten. Zusätzlich konnte in E2F6-/- Fibroblasten eine stärkere Acetylierung von Histon H3 am Stag3 Promotor im Vergleich zu E2f6+/+ Fibroblasten gezeigt werden. Diese Histonacetylierung korreliert mit einer Expression von Stag3 in E2F6 defizienten Zellen. In Einklang damit steht die Beobachtung, dass die stabile Repression von Smc1l2 und Stag3 die Aktivität von Histondeacetylasen benötigt. Außerdem wurde Evidenz für eine Funktion von DNA Methylierungen in der stabilen Smc1l2 und Stag3 Inhibition gewonnen. Somit kann folgendes Modell vorgeschlagen werden: Durch die Bindung von E2F6 werden Histondeacetylasen und/oder Histonmethyltransferasen an die Promotoren meiotischer Kohäsine rekrutiert. Der Nachweis des Polycomb Proteins RYBP auf dem Stag3 Promotor von E2f6+/+ Fibroblasten zeigt, dass eine dauerhafte, stabile und vererbbare Inhibition der Kohäsinexpression möglicherweise durch Polycomb Proteine vermittelt werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Funktion von E2F6 in der Inhibition zell- und differenzierungsspezifischer Gene identifiziert werden. Gleichzeitig wurde Evidenz für einen aktiven E2F6 Repressionsmechanismus erhalten, der durch Histonmodifikationen die Bindung von Polycomb Proteinen an E2F6 regulierte Promotoren ermöglicht

"Untersuchungen zur biologischen Funktion des trankriptionellen Repressors E2F6"

E2F Transkriptionsfaktoren sind zentrale Regulatoren der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. E2F Proteine binden über eine konservierte DNA Bindedomäne an DNA Motiv der Sequenz (T(c/g)CCGC(c/g). Dieses Konsensusmotiv konnte in den Promotoren zahlreicher Gene nachgewiesen werden. Der E2F Familie werden derzeit sieben Proteine zugeordnet (E2F1-E2F7). E2F1-E2F5 sind transkriptionelle Aktivatoren. Ihre transaktivierende Wirkung wird durch die zellzyklusabhängige Bindung an Pocket Proteine (pRb, p107, p130) negativ reguliert. E2F1-E2F5 zeigen eine sowohl spezifische als auch überlappende Funktionen in der Zellzyklusregulation und in der Embryonalentwicklung. Dagegen bilden E2F6 und E2F7 transkriptionelle Repressoren, die nicht an Pocket Proteine binden. Ihre physiologische Funktionen sind unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die in-vivo Funktion von E2F6 analysiert werden. Hierzu wurden E2F6 defiziente Mäuse charakterisiert, die in Vorarbeiten durch Dr. Stefan Gaubatz hergestellt und zur Verfügung gestellt wurden. E2F6 defiziente Mäuse sind lebensfähig, gesund und fruchtbar. E2f6-/- Fibroblasten proliferieren normal und zeigen eine zu den Kontrollzellen identische Zellzyklusverteilung. E2F6 defiziente Fibroblasten arretieren reversibel in der G0 Phase des Zellzyklus. Außerdem induzieren sie eine normale replikative und onkogene Seneszenz. Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen werden, dass E2F6 nicht für die Zellzyklusregulation benötigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei gewebespezifische Phänotypen E2F6 defizienter Mäuse beobachtet werden: Zum einen wurde ein Defekt in der Spermatogenese E2F6 defizienter Männchen festgestellt, dessen molekulare Ursache jedoch unklar ist. Dieser Defekt beeinträchtigt nicht die Fruchtbarkeit von E2f6-/- Mäusen. Zum anderen konnten posteriore homeotische Transformationen entlang der antero-posterioren Achse von Skeletten E2F6 defizienter Mäuse identifiziert werden. Diese ähneln auffällig den Skelettphänotypen Polycomb Protein defizienter Mäuse. Da vorangegangene Studien eine Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen zeigten, konnte durch den in dieser Arbeit beobachteten E2f6-/- Phänotyp erstmals in-vivo Evidenz für einen funktionelle Interaktion von E2F6 mit Polycomb Proteinen erhalten werden. Polycomb Proteine inhibieren die Expression von Hox Genen. Es kann daher spekuliert werden, dass E2F6 Polycomb Proteine an die Promotoren von Hox Gene rekrutiert. Im Gegensatz zu den Polycomb defizienten Mäusen konnte allerdings in ersten Untersuchungen keine deregulierte Expression spezifischer Hox Gene in 9.5 Tage alten E2f6-/- Embryonen nachgewiesen werden. Unter Verwendung eines cDNA Microarrays konnten die meiotischen Kohäsine Smc1l2 (Structural Maintenance of Chromosomes 1l2) und Stag3 (Stromal Antigen 3), sowie das noch nicht charakterisierte Gen XM_196054 als E2F6 regulierte Gene identifiziert und mit verschiedenen experimentellen Ansätzen bestätigt werden. Durch den Nachweis von E2F6 auf dem endogenen Promotor von Stag3 kann eine direkte Regulation von Stag3 durch E2F6 angenommen werden. Weiterhin konnte eine E2F Konsensussequenz im Stag3 und Smc1l2 Promotor identifiziert werden, die eine Bindung von E2F6 ermöglicht und für eine Repression benötigt wird. Anhand dieser Gene wurde in dieser Arbeit der E2F6 vermittelte Repressionsmechanismus untersucht: Dabei konnte beobachtet werden, dass Histon H3 des Smc1l2 und Stag3 Promotors in E2f6+/+, nicht jedoch in E2f6-/- Fibroblasten an H3 Lysin 9 (K9) dimethyliert und am Lysin 27 (K27) trimethyliert ist. Diese Methylierungen korrelieren mit der Repression der Stag3 und Smc1l2 Expression in E2f6+/+ Fibroblasten. Zusätzlich konnte in E2F6-/- Fibroblasten eine stärkere Acetylierung von Histon H3 am Stag3 Promotor im Vergleich zu E2f6+/+ Fibroblasten gezeigt werden. Diese Histonacetylierung korreliert mit einer Expression von Stag3 in E2F6 defizienten Zellen. In Einklang damit steht die Beobachtung, dass die stabile Repression von Smc1l2 und Stag3 die Aktivität von Histondeacetylasen benötigt. Außerdem wurde Evidenz für eine Funktion von DNA Methylierungen in der stabilen Smc1l2 und Stag3 Inhibition gewonnen. Somit kann folgendes Modell vorgeschlagen werden: Durch die Bindung von E2F6 werden Histondeacetylasen und/oder Histonmethyltransferasen an die Promotoren meiotischer Kohäsine rekrutiert. Der Nachweis des Polycomb Proteins RYBP auf dem Stag3 Promotor von E2f6+/+ Fibroblasten zeigt, dass eine dauerhafte, stabile und vererbbare Inhibition der Kohäsinexpression möglicherweise durch Polycomb Proteine vermittelt werden könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Funktion von E2F6 in der Inhibition zell- und differenzierungsspezifischer Gene identifiziert werden. Gleichzeitig wurde Evidenz für einen aktiven E2F6 Repressionsmechanismus erhalten, der durch Histonmodifikationen die Bindung von Polycomb Proteinen an E2F6 regulierte Promotoren ermöglicht

Homeotic transformations of the axial skeleton that accompany a targeted deletion of E2f6

E2F transcription factors play an important role in regulating mammalian cell proliferation. E2F6, the most recently identified E2F family member, is a transcriptional repressor. In an effort to ascertain the in vivo biological function of E2F6, we have generated an E2f6 mutant mouse strain. Mice lacking E2F6 are viable and healthy. Surprisingly, E2f6–/– embryonic fibroblasts proliferate normally. However, E2f6–/– animals display overt homeotic transformations of the axial skeleton that are strikingly similar to the skeletal transformations observed in polycomb mutant mice. This observation is compatible with the recent finding that endogenous E2F6 and one or more mammalian polycomb proteins are components of the same multiprotein complex. The accumulated evidence suggests that, during development, E2F6 participates in the recruitment of polycomb proteins to specific target promoters

Silencing of meiotic genes in somatic cells by E2F6

7 páginas, 6 figuras -- PAGS nros. 41380-41386E2F6, a member of the E2F-family of transcription factors, is a retinoblastoma protein-independent transcriptional repressor. E2F6 associates with polycomb group (Pc-G) multiprotein complexes that contain histone H3 methyltransferases, suggesting that E2F6 represses genes by covalent histone modification. However, genes that are repressed by E2F6 via a mechanism that involves histone H3 methylation have not been identified. Using cDNA microarray experiments comparing wild-type and E2f6-/- mouse embryonic fibroblasts, we now found that E2F6 is required to silence the meiosis-specific genes SMC1β and STAG3 in somatic cells. Re-expression of E2F6 in E2f6-/- cells was sufficient to restore their repression. E2F6 binds in vivo to the promoters of these genes through a conserved binding site. Transcriptional repression of SMC1β and STAG3 by E2F6 involves multiple mechanisms, including methylation of histone H3 on lysine 9 and lysine 27. Our findings suggest a molecular mechanism for the stable transcriptional silencing of meiotic genes in somatic cells by E2F6. Previous SectionNext Section E2F proteins are transcription factors that regulate genes with key roles in cell cycle progression, synthesis of nucleotides, DNA replication, DNA repair, and apoptosis (for a review, see Ref. 1). E2F is a family of eight proteins (E2F1 through E2F8) that can be divided into three major subgroups. E2F1, E2F2, and E2F3a are potent transcriptional activators. Their major role is to activate genes that are involved in proliferation and apoptosis. In contrast, E2F3b, E2F4, and E2F5 function primarily as active transcriptional repressors through binding to the retinoblastoma tumor suppressor protein and related pocket proteins. E2F6, E2F7, and E2F8 lack transactivation domains and are pocket protein-independent repressors (2–10).A mechanism for transcriptional repression by E2F6 was suggested by the observation that E2F6 associates with polycomb proteins and histone methyltransferases (11–13). A contribution of E2F6 to the biological function of polycomb proteins in vivo is supported by the phenotype of mice with a targeted deletion of E2f6, which present with homeotic transformations of the axial skeleton that are very similar to those identified in polycomb-deficient mice (14). However, evidence that E2F6 represses genes in vivo through covalent histone modification is still missing. Indeed, in a recent study it was found that E2F6 represses a set of genes, including the BRCA1 tumor suppressor gene, by competing for activating E2Fs (15). No evidence for a role of histone H3 methylation in repression of these genes was found on these promoters. Here we report a novel function of E2F6 to stably repress certain meiotic genes in somatic cells through multiple mechanisms including methylation of histone H3 on lysine 9 and lysine 27This work was supported by a grant from the Volkswagen Stiftung and by Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant GA 575 (to S. G). The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.Peer reviewe