Human heme oxygenase-1 deficiency: A lesson on serendipity in the discovery of the novel disease

金沢大学大学院医学系研究科血管病態制御学The first case of human heme oxygenase (HO)-1 deficiency was reported by Yachie et al. at our laboratory in the Department of Pediatrics, Angiogenesis and Vascular Development, Kanazawa University Graduate School of Medical Science, in 1999. In the present paper I would like to review this novel disease. Our studies into HO-1 deficiency were called by us \u27Kanazawa version Project X\u27. From the story of our successful discovery we have learned that serendipity is a very important spiritual factor. Serendipity is the making of fortunate and unexpected discoveries by chance (from its possession by the heroes in the Persian fairy tale The Three Princes of Serendip). © 2007 Blackwell Publishing Asia

Auroral O+ 732/733 nm emission and its relation to ion upflow

Observations of auroral oxygen ion emission at 732/733 nm were made at the Aurora station in Longyearbyen (78.2.N, 16.3.E; lm=74.9.) using an all-sky spectrograph (ASG) during the winter season of 2000/2001. A statistical analysis showed that the highest occurrence of oxygen ion auroras at Longyearbyen was seen in the dayside of the 09-12MLT region; the intensities of these auroras were also larger than those on the night side. To study the mechanism of ion up゜ow in the polar ionosphere, ASG data obtained on December 7, 2000, was analyzed together with simultaneous ionospheric data obtained by EISCAT Svalbard radar (ESR). Enhancements of electron temperature and ion upward velocity were associated with an increase in the auroral OII intensity at the magnetic zenith. This result suggests that an ambipolar electric field associated with electron temperature enhancement caused by soft electron precipitation may be involved in the mechanisms that drive ionospheric ions upward

ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の多面的生理学的意義: HO-1欠損症からの学習

本研究は,われわれが世界で初めての新しい疾患「ヒトヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)欠損症」を発見したことに端を発する.患児は2歳頃から,全身性慢性炎症,溶血性貧血を認め,さらに凝固,線溶系の異常亢進,高血圧も認め,6歳で頭蓋内出血で死亡した.本症の原因はヘモグロビンからビリベルディンへの代謝をつかさどるHO-1酵素蛋白の遺伝的欠損症であることが、遺伝子解析からも証明された.本症例のこれまでの病態解析から,本酵素は特に血液単球,腎尿細管,血管内皮の機能発現と維持などの多様な生理学的意義を有することが示唆された。(1)患児および両親のHO-1遺伝子解析から,母親アリルにエクソン2の欠損,父親アリルではエクソン3に2塩基欠損があることがわかり,患児はその複合ヘテロ接合体であることが知れた。さらに母親の染色体遺伝子を検索したところ,エクソン2を含む1,730bpにおよぶ大きな欠損が証明された。さらに,エクソン2はAluくり返し配列にはさまれる構造であることが知れ,本例のエクソン2欠損はAluくり返し配列の相同的組み換えによる配列欠失の可能性が示唆された。(2)HO-1欠損症例では単球に形態および機能異常がみられた。本研究では種々の細菌性,ウイルス感染症,および血管性病変(川崎病など)における血液細胞のHO-1発現状態を比較検討し、特に単球のHO-1発現と種々の感染症病態との関係を明らかにした。HO-1遺伝子プロモーター領域のGTレピート多型には有意差を認めなかった。(3)HO-1欠損症例では尿細管のダメージが経過とともに増悪した。そこで本研究では各種腎疾患におけるHO-1発現を免疫組織染色法、in situ hybridization法で検討した。さらにメサンギウム細胞株と比較すると、ヒト近位尿細管上皮細胞株でHO-1発現がより強く,ストレス感受性が高いことが知れた。(4)細胞株ECV304にHO-1遺伝子を導入した。低〜中等度HO-1蛋白発現株では,ヘミンや過酸化水素などのストレスを負荷すると細胞障害の抑制が認められたが、高度HO-1蛋白発現株では、逆に細胞障害の増強がみられた。このことは、HO-1蛋白発現量が多すぎても、決して防御的には働かず、かえって血管障害を増強する可能性を示唆した。将来の遺伝子治療において、HO-1遺伝子発現を恒常的ではなく、生理的なストレス誘導性とする必要があることを示唆した。The first-described case of human heme oxygenase-1 (HO-1) deficiency is presented. The patient, a 6-year-old boy, similar to HO-1 knockout mice, exhibited severe growth retardation, anemia, iron deposition in renal and hepatic tissue, and vulnerability to stress-related injury with high fever.(1) The genomic analysis revealed that the boy completely lacked HO-1, having a deletion of exon 2 of the maternal allele and a two-base-pair deletion in exon 3 of the paternal allele of the gene. Further analysis revealed structural evidence of genomic exon-deletion (l,730bp) mediated by Alu-Alu recombination in this case.(2) The boy exhibited morphological abnormality of monocytes and significant reduction of their surface molecules including CD11b, CD 14, CD16 and CD36, resulting in a markedly impaired phagocytosis of monocytes. We investigated the importance of monocyte HO-1 production in two in vivo model systems. In acute febrile illnesses monocytes are activated with simultaneous increase o f HO-1 production. In addition, we also examined HO-1 production by alveolar macrophages in childhood pulmonary hypertension, showing well correlation of the level of HO-1 with the degree of pulmonary hypertension.(3) Renal mesangial change in glomerular capillary-wall thickness was shown in the three consecutive biopsy specimens in this case. Tubulointerstitial injury, with tubular dilatation and/or atrophy, interstitial fibrosis, and inflammatory cell infiltration advanced progressively. Electron microscopic examination showed widespread endothelial detachment and subendothelial deposits of an unidentifiable material. Furthermore, we compared the patterns of HO-1 expression and the responses to stress-induced cytotoxicity by primary cultured human mesangial cells (hMCs) and proximal tubular epithelial cells (hTECs) in vitro. The hTECs were shown to be more susceptible to oxidative stress and significantly more dependent on HO-1 expression than the hMCs.(4) We transfected HO-1 gene to die ECV304 cells with a minimal level of HO-1 expression. The high HO-1-expressed cells showed more increase of cell death by H2O2 than die low HO-1-expressed one, indicating that the high expression of HO-1 was not always a good prognostic factor for prevention of stress-induced injuries.From these data based on the first human case of HO-1 deficiency, multilateral physiological functions of die HO-1 enzyme were newly evidenced.研究課題/領域番号:13470160, 研究期間(年度):2001-2002出典：「ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の多面的生理学的意義: HO-1欠損症からの学習」研究成果報告書　課題番号13470160 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

抗がん剤の細胞内代謝および代謝修飾による効果増強と耐性克服に関する研究

金沢大学医学部・附属病院[はじめに]Methotrexate(MTX)耐性克服を目的として、新しい葉酸代謝拮抗剤であるtrimetrexate(TMQ)とCB3717の薬剤に関して、K562白血病細胞およびMTX耐性K562/MTX細胞を標的としてその抗腫瘍効果を調べ、MTXと比較した。また正常ヒト骨髄球系前駆細胞(CFUーG)に対する細胞毒性も検討した。さらにl型leucovorin(lーLV)投与によるこれら腫瘍細胞の細胞障害減弱と骨髄細胞レスキュ-の程度を検討した。[方法]K562とMTX耐性K562/MTX細胞(2x10^3/ml)を10^M〜10^M MTX TMQまたはCB3717とともに24時間培養した。その後lーLV(日本レダリ-)を最終濃度で10^M〜10^M添加し、メチルセルロ-ス(0.8%)を加えて5日間培養し、cloning efficiencyを比較した。正常ヒト骨髄(BM)単核細胞(2x10^5/ml)も抗癌剤と共に24時間培養し、その後lーLVとコロニ-刺激因子(GーCSF、10ng/ml、中外製薬)を添加してさらに14日間培養後、コロニ-形成能(CFUーG)を計数した。[結果]K562細胞とK562/MTX細胞に対するIC_と比較すると、MTXでは100倍以上の耐性が認められたが、TMQとCB3717ではそれぞれ1.5倍、2.2倍であり、耐性度は著明に減少した。骨髄細胞はいずれの抗癌剤に対しても強い耐性を示した。lーLV添加によって腫瘍細胞においてもレスキュ-効果が認められた。K562細胞についてみると、約95%の細胞障害性を示す10^M MTXに10^MlーLVを添加した場合、40.3%+7.1%にまでcloning efficiencyは回復した。TNQとCB3717における回復率はやや低かった(15.1%+5.0%と27.4%+10.8%)。MTX耐性のK562/MTX細胞ではlーLVレスキュ-率はK562細胞に比較して有意に高かった。骨髄(BM)CFUーGについてみると、MTX耐性を克服する高濃度のMTX、TMQ、CB3717いずれの薬剤に対しても、lーLVは50%以上のレスキュ-率を示した。[結論]TMQ、CB3717はいずれもMTX耐性克服に有効と思われた。一方、lーLV添加により、腫瘍細胞も種々の程度でレスキュ-されることが知れた。BM細胞に対するlーLVのレスキュ-効果は高濃度のTMQやCB3717に対しても強く認められ、以上の結果から、適当な薬剤投与量と投与時間を配慮すれば、TMQやCB3717はlーLVの併用でMTX耐性克服に有効と思われる。研究課題/領域番号:02670429, 研究期間(年度):1990出典：研究課題「抗がん剤の細胞内代謝および代謝修飾による効果増強と耐性克服に関する研究」課題番号02670429（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-02670429/）を加工して作

ヘムオキシゲナーゼ1欠損症の発見:その病態の生化学的,分子生物学的解析

金沢大学医学部1)ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)に対する単クローン抗体を用いた生検肝組織の免疫組織染色で患児肝にはHO-1が染色されなかった.2)患児末梢血細胞およびLCL細胞株を用いてウエスタンブロッティング法を実施したところ,HO-2蛋白は対照と同等に発現がみられたが,HO-1蛋白はヘミンなどのストレス刺激後でも全く発現がみられなかった.以上より本例のHO-1欠損症の診断が確定した.3)HO-1mRNAはRT-PCR法により,その発現が確認された.4)患児および両親のHO-1遺伝子解析から,母親ではエクソン2の欠損,父親ではエクソン3に2塩基欠損があることがわかり,患児はその複合ヘテロ接合体であることが知れた.さらに母親アリルにはAlu-Alu関連遺伝子再構成に基づく,エクソン2を含む大きな染色体遺伝子の部分欠損が証明された.5)正常HO-1遺伝子を含むレトロウイルスベクターの作成し,患児細胞株LCLへ遺伝子導入したところ,HO-1蛋白発現と機能の部分的正常化がみられた.ただしこのHO-1発現は恒常的で,生理的にみられるようなストレス誘導性発現ではなかった.6)患児の2度の腎バイオプシー標本と剖検材料の免疫学的検討から,HO-1欠損症では腎尿細管に対するストレス障害が著明であることが知れた.各種腎疾患においても腎尿細管障害が著明であった.7)正常ヒト末梢血単核細胞をフローサイトメトリーで,単球,リンパ球に画分した.細胞刺激後,HO-1mRNA発現をRT-PCRで,HO-1蛋白発現をフローサイトメトリー法でみると,単球画分でHO-1発現が強く,リンパ球では逆に弱く,細胞系特異的なHO-1発現調節機構の存在が示唆された.研究課題/領域番号:11877128, 研究期間(年度):1999 – 2000出典：研究課題「ヘムオキシゲナーゼ1欠損症の発見:その病態の生化学的,分子生物学的解析」課題番号11877128（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11877128/）を加工して作

ヘムオキシゲナーゼ1欠損症の発見:血管内皮傷害病態の解明と遺伝子治療の基礎的研究

本研究の動機は,最近われわれが従来全く報告のない新しい疾患「ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)欠損症」の症例を発見したことによる.世界最初の症例である.患児は2歳頃から,発熱,白血球増多,関節炎を伴う慢性炎症,肝腫大,赤ワイン色血清,赤血球破砕を伴う溶血性貧血を認め,さらに凝固,線溶系の異常亢進,vWF因子,トロンボモデュリン,血管内皮由来サイトカインの高値から毛細血管内皮細胞障害が疑われた.高血圧を認め,6歳で死亡した.高脂血症も認めた.本症例では溶血が存在するにもかかわらず,低ビリルビン血症,高ハプトグロビン血症がみられることが病態解明のきっかけとなり,検索の結果,本症の原因はヘモグロビンからビリベルディンへの代謝をつかさどるHO-1酵素蛋白の遺伝的欠損症であることが解明された.HO-1は感染,低酸素などにより強く誘導発現され,生体に対する酸化ストレス防御因子として重要である.さらにHO-1はCOを合成し,COは微小循環を確保し,毛細血管内皮の保護とその機能恒常性の維持に重要である.したがって本例にみられる多彩な症状は,HO-1欠損による血管内皮細胞障害,血液細胞障害やストレス防御機構の破綻に起因する可能性が高い.これまでに本症例の解析,および関連する研究で次の点が明らかになった.1)HO-1遺伝子解析から,母親ではエクソン2の欠損,父親ではエクソン3に2塩基欠損があることがわかり,患児はその複合へテロ接合体であった.さらに母親アリルにはAlu-Alu関連遺伝子再構成に基づく,エクソン2を含む大きな染色体遺伝子の部分欠損が証明された.2)正常HO-1遺伝子を含むレトロウイルスベクターの作成し,患児細胞株LCLへ遺伝子導入したところ,HO-1蛋白発現と機能の部分的正常化がみられた.ただしこのHO-1発現は恒常的で,生理的にみられるようなストレス誘導性発現ではなかった.3)本症例では特に,尿細管の傷害が経過とともに増悪した.電顕では血管内皮の剥離と異常物質の沈着が認められた.4)血管内皮細胞株ECV304にHO-1遺伝子をレトロウイルスベクターを用いてトランスフェクトし,HO-1蛋白発現の異なる種々の細胞株が樹立された.それらの細胞株のストレスに対する抵抗性を検討した.The first-described case of heme oxygenase-1 (HO-1) deficiency is presented. The patient, a 6-year-old boy, completely lacks HO-1, having a deletion of exon 2 of the maternal allele and a two-base-pair deletion in exon 3 of the paternal allele of the gene. Further analysis revealed structural evidence of genomic exon-deletion mediated by Alu-Alu recombination in this case. Similar to recently described HO-1 knockout mice, the boy exhibits severe growth retardation, anemia, iron deposition in renal and hepatic tissue, and vulnerability to stress-related injury. Mesangial change in glomerular capillary-wall thickness was shown in the three consecutive biopsy specimens. Electron microscopic examination showed widespread endothelial detachment and subendothelial deposits of an unidentifiable material. It was striking that tubulointerstitial injury, with tubular dilatation and/or atrophy, interstitial fibrosis, and inflammatory cell infiltration, advanced progressively. In addition, the boy exhibited morphological abnormality of monocytes and significant reduction of their surface molecules including CD11b, CD14, CD16 and CD36, resulting in a markedly impaired phagocytosis of monocytes.Heme oxygenase, which catalyzes the conversion of heme into carbon monoxide and biliverdin, plays an important anti-inflammatory role in oxidative injury. The two known isoforms differ in their expression pattern, with HO-2 constitutively expressed in brain and testis, and HO-1 expressed ubiquitously at low levels, although it is rapidly induced following various stresses. The importance of the current work may lie less in its being the first described case of human HO-1 deficiency than in the clues it provides to the normal functions of this important enzyme.研究課題/領域番号:11470170, 研究期間(年度):1999-2000出典：「ヘムオキシゲナーゼ1欠損症の発見:血管内皮傷害病態の解明と遺伝子治療の基礎的研究」研究成果報告書　課題番号11470170(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

NK細胞の分化段階と造血幹細胞分化増殖調節機構への関与, NK細胞性白血病症例の検討

金沢大学医学部附属病院NK細胞は造血幹細胞の分化, 増殖機構の調節に重要な役割を担っていることが知られている. 我々は14才女子のNK細胞白血病症例を経験した. このNK細胞はLGL細胞の形態を有し, 表面形質は, Leu7陰性,Leu11陽性であった. 又T11陽性だが, T3,T8,OKM1陰性で, Tγリンパ球に属すると考えられた. NK活性は低値であったが, γIL2で著明に増強された. しかし, IFNγでは増強されなかったことより, このNK亜型は, 未熟NK, 又はNK前駆細胞に相当すると思われた. ADCC及びLAK活性もγIL2刺激後に認められた. 本症例では, 経過中常に顆粒球減少症が認められたため, invitroコロニー法で, NK細胞のヒト骨髄CFU-Cに対する影響を検討した. γIL2刺激後のNK細胞を添加したところ著明なCFU-Cの減少が認められた. NK細胞の培養上清にも同様な強い抑制効果が認められた. 上清を抗IFNγ抗体で前処理することにより抑制効果が解除された. 抗IFNの抗体では2つのような効果は認められなかったことより, 上清中のIFNγがCFU-C抑制に重要な役割を演じているものと思われた. 患者血液中でもIFNγの高値が測定された. 以上の結果より, Leu7^-,Leu11^+NK細胞は, IL2の刺激により, IFNγの産生を介して, 骨髄顆粒球系前駆細胞の増殖を抑制していると考えられた.Natural killer (NK) cells, morphologically indistinguishable from large granular lymphocytes (LGLs), are thought to have an important role in the regulation of hematopoiesis. A clonal leukemic population of NK cells was isolated from a 14-year-old girl. They had a Leu-11^+, Leu-7^- phenotype. Since the NK activity was low but was remarkably augmented by stimulation with recombinant human interleukin 2 (rIL-2), but not interferon- (IFN-), this NK subset seems to belong to a premature stage in the maturation of NK cells. Because of severe neutropenia throughout the clinical course, we investigated the effects of this NK subpopulation on the in vitro growth of granulocyte-macrophage colony forming cells (GM-CDC). When this NK subset in the presence of rIL-2 was added to the GM-CFC assay system employing normal bone marrow cells, a remarkable suppression of GM-CFC was demonstrated. Culture supernatants from the rIL-2-stimulated NK cells, which had a high level of IFN-, also exhibited a significant suppressive activity. Treatment of the supernatants with a specific antibody against IFN- abrogated the inhibitory effect on GM-CFC. These data indicate that this unique subset of premature NK cells in the presence of rIL-2 produceIFN- which seems to be involved in the suppression of myelopoietic progenitor cells.研究課題/領域番号:61570447, 研究期間(年度):1986 – 1987出典：研究課題「NK細胞の分化段階と造血幹細胞分化増殖調節機構への関与, NK細胞性白血病症例の検討」課題番号61570447（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-61570447/615704471987kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

A new meridian imaging spectrogarph for the auroral spectroscopy

Spectroscopic and monochromatic imaging observations of emissions in the upper atmosphere are mutually complementary. A meridian imaging auroral spectrograph (ASG) that can measure a spectrum in the visible region along a meridian has been developed for research on the auroral physics and the polar upper-atmosphere dynamics. Combination of a fast optical system inherited from a monochromatic all-sky imager, a grism as a dispersive element, and a cooled CCD camera has enabled a wide field-of-view of 180° along a meridian, spectral coverage of 420-730 nm, spectral resolution of 1.5-2.0 nm, and high sensitivity to be obtained. The absolute sensitivity over a full-image field was calibrated using a National Institute of Standards and Technology (NIST) traceable integrating sphere and determined to be 0.06 cts/s/R at a wavelength of 560 nm at the zenith. The ASG was installed at Longyearbyen in March 2000, and routine operation was started in the 2000/2001 winter season. An example of an auroral spectral image is presented in this report to demonstrate the performance of the ASG

ヘムオキシゲナーゼ1欠損と全身性慢性炎症に対する防御機構の破綻

ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)はヘムを一酸化炭素(CO)とビリルビンとフェリチン(Feより誘導される)に代謝する律則酵素である。われわれが世界で初めて発見した「ヒトHO-1欠損」症例(1999)は2歳頃からの全身性慢性炎症が増悪し,6歳で死亡した。本症例のこれまでの詳細な病態解析とin vitro実験的研究によって、HO-1の、生体へのストレス防御因子としての役割を解明し、下記の研究成果を得た。(1)患児の生検材料やリンパ球細胞株でHO-1の発現が認めらないことと、HO-1遺伝子の異常から本疾患が確立された。(2)HO-1欠損症の臨床特徴は、主として造血系単球と血管内皮細胞及び腎尿細管細胞の障害に起因する。(3)HO-1欠損症では、外因性酸化ストレスによって、全身性炎症と凝固線溶系の著しい亢進を惹起し、ストレスが長期に継続すると、免疫系や凝固線溶系が消耗、破壊される。(4)単球細胞表面抗原の異常、貪食能の低下が認められた。また、CD16high/CCR2-の細胞亜群にHO-1発現が強く、この細胞群の動態は細菌性感染症とウイルス性感染症で異なっていることから、単球のHO-1発現が各種感染症の病態表現に深くかかわっていることが示唆された。さらに、単球のHb/Hp/CD163コンプレックスがHO-1誘導と強く相関することがわかった。(5)各種腎疾患の生検材料、及びin vitro細胞株の検討から、HO-1は腎尿細管上皮がストレス防御に有効に働いていることが強く示唆された。さらに尿沈さ細胞中のHO-1濃度測定は、腎尿細管傷害を観察する非侵襲的な方法として有用であろうと思われた。(6)以上、HO-1欠損症の詳細な検討は、システミックな炎症発症における新しい病態機序の解明に役立ち、そして、新しい治療法の開発に繋がるかの知れない。Heme oxygenase (HO) is the rate-limiting enzyme that adds an oxygen molecule to the porphyrin ring of heme, thereby catalyzing the oxidation of heme to biliverdin/ bilirubin, free iron, and carbon monoxide (CO). By producing these metabolites, HO plays a crucial role in humans as a defense factor against a variety of oxidative stresses. The first case of human HO - 1 deficiency was reported by Yachie, et. Al. in our laboratory in 1999. A series of clinical and laboratory investigation of the patient with HO-1 deficiency revealed that (1) The boy completely lacked HO-1, genetically having a two-base-pair deletion in exon 3 of the paternal allele of the gene and a deletion of exon 2 of the maternal allele with genomic exon-deletion (1,730bp) mediated by Alu-Alu, recombination. (2) Dysfunction of both monocytes and endothelial cells was remarkably demonstrated. (2) External continuous stresses triggered excessive systemic inflammatory reactions and marked abnormalities of the coagulation/ fibrinolysis system, resulting finally in exhaustion of immune and coagulation system. (3) Morphological abnormality of monocytes and significant reduction of their surface molecules resulted in a markedly impaired phagocytosis of monocytes. Furthermore, the selective expansion of a CD16+++, CCR2- subpopulation of monocytes that preferentially produced HO-1 mRNA was shown during the acute phase of infections including both bacterial and viral infections. HO-1 production by alveolar macrophages in childhood pulmonary hypertension correlated with overexpression of CD1G3 surface molecules was also demonstrated. (4) Progressive renal tubulointerstitial injury was remarkable in the patient with HO-1 deficiency. Enhanced production of HO-lin proximal tubular epithelial cells as compared with mesangial cells was shown in variety of renal biopsy specimen as well as in vitro experiment. Recently HO-1 production by urinary tract cells and evaluation of tubulointestinal injury of the kidney was investigated by MA analysis of urinary sediments. Detailed analysis of HO-I deficiency may offer a valuable tool to understand the pathogenesis of and to develop a novel therapeutic approach to systemic inflammatory illnesses.研究課題/領域番号:17390298, 研究期間(年度):2005-2007出典：「ヘムオキシゲナーゼ1欠損と全身性慢性炎症に対する防御機構の破綻」研究成果報告書　課題番号17390298 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

Fluo-3を用いた、低レベルの抗癌剤多剤耐性細胞の迅速解析と耐性克服剤の検討

[目的]P-糖蛋白のefflux pumpとしての機能性を応用して、多剤耐性(MDR)細胞の、新しい蛍光プローベFluo-3を用いた機能的解析の可能性を検討し、Rhodamine-123と比較した。[方法]薬剤感受性K562親株、多剤耐性K562/VCR、K562/ADR細胞、その感受性復元細胞、MTXのみ耐性で非多剤耐性K562/MTX細胞、多剤耐性であるがP-糖蛋白陰性K562/THPADR細胞を使用した。細胞(10^6/ml 5%FCS加RPMI1640)を37℃保温後、Fluo-3A/M(4μM)またはRh-123(1μM)を添加した。20分後に530nmで平均蛍光強度(mcf)をflow cytometer(Cytoron Absolute)で測定した。さらにP-糖蛋白阻害剤のverapamil(Ver,20μM)やcepharanthine(CP,10μM)を添加してmcfの変化を観察した。Effluxパターンは細胞を洗浄後30分、60分で検討した。P-糖蛋白発現はMRK16抗体を用いた免疫蛍光染色法によった。MDRmRNAはRT-PCR法によった。[結果]K562/VCRとK562/ADRではFluo-3,Rh-123ともに細胞内蓄積低下とVer/CPによる排泄遅延がみられた。P-糖蛋白発現のみられないK562/THPADR,K562/MTXではVer/CPによるFluo-3の排泄遅延が認められたがRh-123ではみられなかった。MDR1mRNA発現はP-糖蛋白陰性の細胞も含めてすべての細胞でみられた。[結論]以上より、Rh-123はP-糖蛋白発現をより明確に表現したが、Fluo-3はMDR1mRNAを発現する低レベルの多剤耐性の検出に有用かもしれない。Six cell lines including drug-sensitive K562/parent cells, multidrug-resistant(MDR) K562/VCR, K562/ADR and K562/tetrahydropyranyl(THP)-ADR cells, methotrexate-resistant K562/MTX and revertant K562/ADR-R cell lines were used in this study : Although P-glycoprotein(P-gp)was overexpressed only in K562/VCR and K562/ADR cells, the RT-PCR method revealed distinct expression of MDR1mRNA even in the K562/parent cells. Intracellular accumulation of Fluo-3 and rhodamine-123 (Rh-123) was measured by incubation of cells with 4 muM Fluo-3 or 1muM Rh-123 for 20 min. by using a flow cytometer. Verapamil(Ver, 20 muM) or cepharanthine (biscoclaurine alkaloid, CP, 10muM) was added just before the addition of the fluorescent agents, Efflux patterns were also studied 30 and 60 min. after incubation with or without Ver ad CP.Increased intracellular accumulation and delayd efflux pattern of Fluo-3 by Ver and CP were shown in MDR K562/VCR and K562/ADR cells, and most interestingly, similar increase of uptake and delayd efflux pattern of Fluo-3 by Ver and CP butin a lower grade, were also demonstrated in P-gp-non-expressed K562/parent, K562/MTX and K562/THP cells. Accumulation of Rh-123 waas not influenced by Ver and CP.Thirteen of 31 clinical leukemic cell samples expressing MDR1mRNA, but not P-gp demonstrated enhancement of intracellular accumulation of Fluo-3 by Ver and Cp, indicating that flow cytometric functional analysis using Fluo-3 with Ver and CP may be usefl for more sensitive functional assay of low-grade multidrug resistance.研究課題/領域番号04670582, 研究期間(年度):1992-1993出典：「Fluo-3を用いた、低レベルの抗癌剤多剤耐性細胞の迅速解析と耐性克服剤の検討」研究成果報告書　課題番号04670582(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作