Corynebacterium diphtheriae invasion-associated protein (DIP1281) is involved in cell surface organization, adhesion and internalization in epithelial cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p><it>Corynebacterium diphtheriae</it>, the causative agent of diphtheria, is well-investigated in respect to toxin production, while little is known about <it>C. diphtheriae </it>factors crucial for colonization of the host. In this study, we investigated the function of surface-associated protein DIP1281, previously annotated as hypothetical invasion-associated protein.</p> <p>Results</p> <p>Microscopic inspection of DIP1281 mutant strains revealed an increased size of the single cells in combination with an altered less club-like shape and formation of chains of cells rather than the typical V-like division forms or palisades of growing <it>C. diphtheriae </it>cells. Cell viability was not impaired. Immuno-fluorescence microscopy, SDS-PAGE and 2-D PAGE of surface proteins revealed clear differences of wild-type and mutant protein patterns, which were verified by atomic force microscopy. DIP1281 mutant cells were not only altered in shape and surface structure but completely lack the ability to adhere to host cells and consequently invade these.</p> <p>Conclusions</p> <p>Our data indicate that DIP1281 is predominantly involved in the organization of the outer surface protein layer rather than in the separation of the peptidoglycan cell wall of dividing bacteria. The adhesion- and invasion-negative phenotype of corresponding mutant strains is an effect of rearrangements of the outer surface.</p

Lipokonjugate als neues Werkzeug zur mikrostrukturierten Funktionalisierung von Oberflächen in biochemischen und zellulären Assays

Lipokonjugate wurden als neue Strategie für eine mikrostrukturierte Funktionalisierung von Oberflächen etabliert. Niedermolekulare Bausteine, wie Haptene und Peptide werden kovalent an eine Pam3Cys (N-Palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-(R)-cystein) Ankergruppe gekoppelt. Wässrige Lösungen dieser mit drei Acylresten modifizierten Lipoaminosäure werden auf hydrophob silanisierte Glasträger aufpipettiert. Durch den Einsatz dieses mit drei Acylresten substituierten Lipides wird der Abstand zwischen den funktionellen Endgruppen erhöht. Auf diese Weise wird eine optimale Zugänglichkeit für die Erkennung durch Biomoleküle wie z. B. Antikörper gewährleistet, ohne dass weitere nicht-funktionalisierte Lipopeptide zugesetzt werden müssen. Die Immobilisierung der Lipokonjugate auf dem Substrat erfolgt nicht-kovalent. Im Gegensatz zu Strategien, bei denen die Anbindung kovalent erfolgt, besteht kein Risiko, dass durch Verlust reaktiver Gruppen die biologische Aktivität der Testsubstanz beeinflusst werden könnte. Trotz des Fehlens einer kovalenten Anknüpfung ist die Funktionalisierung mit Lipokonjugaten stabil gegenüber den Bedingungen biochemischer Bindungsassays und sogar gegenüber Zellwachstum. Die Anwendbarkeit im Screening von Molekülkollektionen auf Proteinbindung wurde anhand der Bindung von fluoreszent markiertem Streptavidin und indirekte Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Peptid-Lipokonjugate gezeigt (Abb. 1). In Hinblick auf die Anwendung in zellbiologischen Microarrays wurde die Biokompatibilität der Oberflächen für das Wachstum von adhärenten Zellkulturzellen demonstriert (Abb. 2). Ferner konnte durch Funktionalisierung mit Antikörpern, die Oberflächenmoleküle von Zellen in Suspension erkennen, eine spezifische Anheftung der Zellen an die Oberflächen erreicht werden

Imaging viscoelastic properties of live cells by AFM: power-law rheology on the nanoscale

We developed force clamp force mapping (FCFM), an atomic force microscopy (AFM) technique for measuring the viscoelastic creep behavior of live cells with sub-micrometer spatial resolution. FCFM combines force–distance curves with an added force clamp phase during tip-sample contact. From the creep behavior measured during the force clamp phase, quantitative viscoelastic sample properties are extracted. We validate FCFM on soft polyacrylamide gels. We find that the creep behavior of living cells conforms to a power-law material model. By recording short (50–60 ms) force clamp measurements in rapid succession, we generate, for the first time, two-dimensional maps of power-law exponent and modulus scaling parameter. Although these maps reveal large spatial variations of both parameters across the cell surface, we obtain robust mean values from the several hundreds of measurements performed on each cell. Measurements on mouse embryonic fibroblasts show that the mean power-law exponents and the mean modulus scaling parameters differ greatly among individual cells, but both parameters are highly correlated: stiffer cells consistently show a smaller power-law exponent. This correlation allows us to distinguish between wild-type cells and cells that lack vinculin, a dominant protein of the focal adhesion complex, even though the mean values of viscoelastic properties between wildtype and knockout cells did not differ significantly. Therefore, FCFM spatially resolves viscoelastic sample properties and can uncover subtle mechanical signatures of proteins in living cells