Functional characterization of the Mediator subunit MED25

In this study a structure–function analysis has been employed to analyze transcriptional regulation through the Mediator subunit MED25. A relationship could be established between predicted structural domains and functional characteristics of this protein. Most critically the region responsible for interaction of MED25 with the Mediator was identified. Immunoprecipitation experiments demonstrated that the so–called VWA domain (von–Willebrand A domain, amino acids 1–290) is both sufficient and required for this contact. Site–directed mutagenesis indicates that this binding reaction involves the non–conserved loop SR2, which is protruding from this domain. Based on the results of this analysis a model was proposed, in which the primary contact is established by ionic forces and is further stabilized by hydrophobic interactions. The previously identified ACID domain was reported to bind to VP16. Targeted mutagenesis of four different motifs in this region impaired not only transcriptional activation through MED25 but also led to reduced binding to VP16. In particluar a lysine–rich motif is also present in two domains of PTOV1, a close homolog of MED25. Noteworthy, K518 is not conserved in the PTOV1_B domain, which in contrast to PTOV1_A and the ACID domain of MED25 does not bind to VP16. This led to the hypothesis that K518 is critically involved in the binding of VP16 to MED25. Furthermore it could be demonstrated that MED25 contains an intrinsic transcriptional activation capacity, which is localized in the region 290–715. This indicates additional recruitment of other factors to promoters through this region. Together with the Mediator binding VWA–domain and the VP16–interaction domain this region might facilitate transcriptional activation. A genome–wide screen showed downregulation of c–Jun and FosB following overexpression of MED25. Interestingly, expression of GSK3β, a downstream target of which is cyclin D1, seems to be stimulated by MED25. Together with the finding that overexpression of MED25 leads to activation of a p21 reporter, this raises the possibility that MED25 is involved in cell cycle control. An overlap has been discovered by comparison of MED25 target genes and genes identified previously as target for the viral activator EBNA2. The close homology between the activation domains of EBNA2 and VP16 implies a common mechanism of transcriptional activation by these two viral proteins through MED25. The involvement of MED25 in gene activation by viral activators might indicate a role for this Mediator subunit in viral transcription

Identification of the variant Ala335Val of MED25 as responsible for CMT2B2: molecular data, functional studies of the SH3 recognition motif and correlation between wild-type MED25 and PMP22 RNA levels in CMT1A animal models

Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease is a clinically and genetically heterogeneous disorder. All mendelian patterns of inheritance have been described. We identified a homozygous p.A335V mutation in the MED25 gene in an extended Costa Rican family with autosomal recessively inherited Charcot-Marie-Tooth neuropathy linked to the CMT2B2 locus in chromosome 19q13.3. MED25, also known as ARC92 and ACID1, is a subunit of the human activator-recruited cofactor (ARC), a family of large transcriptional coactivator complexes related to the yeast Mediator. MED25 was identified by virtue of functional association with the activator domains of multiple cellular and viral transcriptional activators. Its exact physiological function in transcriptional regulation remains obscure. The CMT2B2-associated missense amino acid substitution p.A335V is located in a proline-rich region with high affinity for SH3 domains of the Abelson type. The mutation causes a decrease in binding specificity leading to the recognition of a broader range of SH3 domain proteins. Furthermore, Med25 is coordinately expressed with Pmp22 gene dosage and expression in transgenic mice and rats. These results suggest a potential role of this protein in the molecular etiology of CMT2B2 and suggest a potential, more general role of MED25 in gene dosage sensitive peripheral neuropathy pathogenesis

Concordanza e discordanza tra sintomi e segni di occhio secco e uso di lenti a contatto associato a ad occhio secco

L’obiettivo dell’elaborato sarà quello di definire la sindrome di occhio secco e la sua classificazione, identificare i test usati per diagnosticare e monitorare la sindrome, presentare le modalità atte a garantire una diagnosi differenziale di occhio secco scongiurando la presenza di comorbidità ovvero, in ambito medico, la copresenza di diverse patologie in un unico individuo. (1) Nonostante i notevoli progressi legati alla maggior competenza diagnostica, un’accurata diagnosi di occhio secco risulta impegnativa data la vasta gamma di sintomi e il fatto che spesso i cambiamenti e i segni non corrispondano ai sintomi riportati dal paziente. Inoltre, alla base della difficoltà diagnostica vi è anche la mancanza di una valutazione clinica affidabile, unica ed inequivocabile. Vi è un’ampia disponibilità di test dedicati alla valutazione dei segni relativi alla sindrome di dry eye e alla differenziazione tra test per quantificare la produzione e stabilire la qualità del film lacrimale e quelli per stadiare l’integrità della superficie oculare. Tuttavia, l’eterogeneità dei sintomi rende complessa sia l’individuazione della problematica tramite l’osservazione dei segni, poiché non vi è una corrispondenza lineare tra segni e sintomi, sia la diagnosi e la gestione della sindrome di occhio secco a causa della mancanza di un test univoco che permetta un’accurata valutazione della progressione e della risposta all’eventuale trattamento ritenuto idoneo. (2) Questo elaborato mira ad una revisione sistematica della letteratura relativa allo studio della relazione tra sintomi e segni di dry eye poiché la mancanza di corrispondenza può avere un impatto significativo sia sulla diagnosi sia sulla gestione del trattamento. In particolare, sono stati selezionati diversi studi a dimostrazione della scarsa e spesso inconsistente correlazione tra segni e sintomi rendendo necessario, in fase clinica, l’utilizzo di un insieme di test diagnostici per evitare che i risultati di un test eseguito singolarmente risultino fuorvianti. (2) Inoltre, si passeranno in rassegna i motivi per cui il discomfort e la secchezza rientrano tra le prime ragioni di intolleranza e drop out delle lenti a contatto. Infatti, il materiale, il design, la bagnabilità e il coefficiente di frizione delle lenti a contatto possono avere un’incidenza significativa legata al CLADE (Contact Lens-Associated Dry Eye Disease). Sebbene, gli effetti delle proprietà delle lenti a contatto sulla superficie oculare non siano ancora chiari. (3) Nel corso dell’esposizione si intende fornire una linea guida che non vuole sostituirsi alla valutazione e al giudizio clinico di esperti, la nuova definizione di occhio secco presentata in occasione del Workshop Internazionale dell’Occhio Secco ha come obiettivo quello di fornire una linea guida ragionevole per la terapia. La definizione è strutturata in tre parti principali, prende le mosse dall’eziopatogenesi atta a illustrare le varie cause di occhio secco, la seconda parte pone l’accento sul meccanismo patogenetico e mostra come le diverse cause di occhio secco possano interagire tra loro e aggravare altre concause come parte di un circolo vizioso. Infine, l’ultima parte illustra uno schema di classificazione della severità dell’occhio secco