Micropartículas funcionalizadas com toxinas isoladas de Crotalus durissus terrificus como terapia experimental na leishaniose cutânea

Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Biologia Experimental scricto sensu da Universidade Federal de Rondônia para obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Roberto NicoleteAs leishmanioses encontram-se entre as doenças infectoparasitárias de maior incidência no mundo. Causada por protozoários do gênero Leishmania spp., essa doença acomete mais de 12 milhões de pessoas em 88 países, com cerca de 350 milhões sob o risco de adoecer. As drogas disponíveis para o tratamento da leishmaniose apresentam elevada toxicidade e nenhuma delas é suficientemente eficaz. Vários trabalhos têm descrito venenos de serpentes, bem como, suas toxinas como compostos com potencial atividade antiparasitária. Neste contexto, a produção de protótipos de fármacos abordando a micro ou nanotecnologia é uma alternativa promissora, visto que diferentes moléculas podem ser direcionadas para a célula alvo contendo o protozoário. O objetivo desse trabalho foi encapsular toxinas isoladas de Crotalus durissus terrificus em micropartículas poliméricas biodegradáveis, constituídas pelo Ácido Poli Lático co-Glicólico (PLGA) e avaliar sua atividade in vitro contra Leishmanina amazonensis. Análises de interação molecular entre as proteínas de L. amazonensis e as toxinas crotamina e crotoxina foram realizadas por Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS). As micropartículas produzidas foram caracterizadas in vitro, através da análise dos diâmetros, Potencial Zeta, taxa de encapsulação e morfologia. A viabilidade das promastigotas expostas às toxinas encapsuladas e em solução foi avaliada através do ensaio colorimétrico de MTT. O ensaio de toxicidade de macrófagos murinos incubados com as micropartículas foi realizado pelo método colorimétrico de MTT. Além disso, foi determinado o índice fagocítico de macrófagos peritoneais incubados com micropartículas e o sobrenadante celular foi coletado para dosagem da citocina TNF-α. Também foi realizado um ensaio de infecção in vitro de macrófagos peritoneais com promastigotas de L. amazonensis. Os resultados de interação mostraram que a crotamina apresentou uma elevada afinidade e/ou interação com as proteínas presentes no extrato bruto de leishmania. Os diâmetros e potencial zeta das partículas controle e contendo crotamina foram (1,3 μm e -12,3 mV) e (3,0 μm e - 20,9 mV), respectivamente. As micropartículas contendo crotamina apresentaram efeitos similares (em torno de 18% de inibição) contra as formas promastigotas de L. amazonensis, após 24 e 48 horas de incubação. As partículas controle e contendo crotamina apresentaram toxicidade inferior a 5% em macrófagos peritoneais. O ensaio de fagocitose de micropartículas por macrófagos peritoneais mostrou que a quantidade de micropartículas contendo crotamina que foram capturadas foi superior a de micropartículas controle. Os maiores níveis de TNF-α detectados foram obtidos quando os macrófagos foram incubados com micropartículas contendo crotamina e também crotamina em solução. Macrófagos que capturaram micropartículas contendo crotamina apresentaram menor Índice Fagocítico quando comparados com os macrófagos apenas infectados. A aplicação desta tecnologia no modelo de infecção in vitro por L. amazonensis, envolvendo a liberação intracelular de uma toxina revelou-se segura e inovadora para o desenvolvimento de terapias alternativas/complementares contra a leishmaniose cutânea

Leukotriene B4-loaded microspheres: a new therapeutic strategy to modulate cell activation

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Leukotriene B₄(LTB₄) is a potent inflammatory mediator that also stimulates the immune response. In addition, it promotes polymorphonuclear leukocyte phagocytosis, chemotaxis, chemokinesis and modulates cytokines release. Regarding chemical instability of the leukotriene molecule, in the present study we assessed the immunomodulatory activities conferred by LTB₄released from microspheres (MS). A previous oil-in-water emulsion solvent extraction-evaporation method was chosen to prepare LTB₄-loaded MS.</p> <p>Results</p> <p>In the mice cremasteric microcirculation, intraescrotal injection of 0.1 ml of LTB₄-loaded MS provoked significant increases in leukocyte rolling flux, adhesion and emigration besides significant decreases in the leukocyte rolling velocity. LTB₄-loaded MS also increase peroxisome proliferator-activated receptor-α (PPARα) expression by murine peritoneal macrophages and stimulate them to generate nitrite levels. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and nitric oxide (NO) productions were also increased when human umbilical vein and artery endothelial cells (HUVECs and HUAECs, respectively) were stimulated with LTB₄-loaded MS.</p> <p>Conclusion</p> <p>LTB₄-loaded MS preserve the biological activity of the encapsulated mediator indicating their use as a new strategy to modulate cell activation, especially in the innate immune response.</p

Upregulation of hsa-miR-125b in HTLV-1 asymptomatic carriers and HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis patients

The retrovirus human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) promotes spastic paraparesis, adult T cell leukaemia and other diseases. Recently, some human microRNAs (miRNAs) have been described as important factors in host-virus interactions. This study compared miRNA expression in control individuals, asymptomatic HTLV-1 carriers and HTLV-1 associated myelopathy (HAM)/tropical spastic paraparesis patients. The proviral load and Tax protein expression were measured in order to characterize the patients. hsa-miR-125b expression was significantly higher in patients than in controls (p = 0.0285) or in the HAM group (p = 0.0312). Therefore, our findings suggest that miR-125b expression can be used to elucidate the mechanisms of viral replication and pathogenic processes.FAPESP [06/59388-4]FAPESPCNPqCNPqFUNDHERPFUNDHER

Celecoxib Improves Host Defense through Prostaglandin Inhibition during Histoplasma capsulatum

Prostaglandins act as mediators of inflammation and, similar to cytokines, function as immune modulators during innate and adaptive immune responses. Therefore, using a pharmacological inhibitor, celecoxib, we investigated the role of prostaglandins in host defense against Histoplasma capsulatum infection in C57BL/6 mice. Our results showed that treatment with celecoxib inhibited cyclooxygenase 2, reduced the total fungal burden, and reduced the concentration of PGE(2), cytokines, lymphocytes, neutrophils, and mononuclear cells in the bronchoalveolar space and lung parenchyma. In addition, celecoxib treatment increased the synthesis of nitric oxide, IFN-γ, LTB(4), and the phagocytic capacity of alveolar macrophages. Moreover, celecoxib treatment increased the survival of mice after infection with a lethal inoculum of H. capsulatum. These results suggest that prostaglandins alter the host immune response and play an important role in the pathogenesis of histoplasmosis. Thus, the inhibition of prostaglandins could be a valuable immunomodulatory strategy and antifungal therapy for histoplasmosis treatment

Studies about the effects of the in vivo administration of Leukotriene B4 or Prostaglandin E2-loaded biodegradable microspheres on model of murine histoplasmosis

Leucotrienos e prostaglandinas são metabólitos do ácido araquidônico que, além de mediadores da inflamação são importantes imunomoduladores da liberação de citocinas, nas respostas imune inata e adquirida. Embora estes mediadores apresentem potencial para serem utilizados como adjuvantes ou imunomoduladores da resposta imune, eles são altamente instáveis, dificultando o uso in vivo. Por esta razão, estas substâncias foram incorporadas em um sistema polimérico microestruturado. Este foi constituído de microesferas de quatro a seis micrômetros de diâmetro, contendo leucotrieno B4 (LTB4) ou prostaglandina E2 (PGE2) incorporados na matriz polimérica (PLGA). A caracterização in vitro das microesferas de PLGA, contendo LTB4 ou PGE2, foi feita através da determinação da morfologia e medida dos diâmetros médios, taxa de encapsulação e perfil de liberação in vitro dos mediadores. Além disso, foi avaliada a preservação da atividade biológica do LTB4 liberado das microesferas, através do efeito do mesmo sobre a expressão de moléculas de adesão Mac-1 por citometria de fluxo. Também foram avaliadas a preservação da atividade biológica do LTB4 e da PGE2 liberados do interior das microesferas, através de estudos com microscopia intravital e a ativação de células endoteliais humanas (HUVECs e HUAECs). Realizamos ainda, ensaio de fagocitose com as microesferas contendo os dois mediadores encapsulados, utilizando macrófagos peritoneais murinos, além da avaliação da sobrevivência dos animais tratados intranasalmente com microesferas contendo LTB4 ou PGE2 durante a infecção pelo H. capulatum. Nestes animais, avaliamos a reação inflamatória pulmonar, o número de UFCs recuperadas dos pulmões e a modulação da resposta imune, através da quantificação de citocinas inflamatórias. Os estudos abordados neste trabalho revelaram achados interessantes e importantes quanto ao uso de microesferas biodegradáveis contendo mediadores lipídicos em situação de terapia, especialmente quando estes estão envolvidos em processos inflamatórios e/ou infecciosos.Leukotrienes and prostaglandins are arachidonic acid metabolites, which participate in the inflammatory response and modulate cytokines release in both adaptive and innate immune responses. However, some physicochemical characteristics of these mediators, such as poor solubility in water and chemical instability, make them difficult to administer in vivo. In this sudy, we developed a polymeric microparticulate system for the encapsulation of lipid mediators. Regarding the in vitro characterization of the microspheres, we determined their diameters, evaluated the in vitro release of the mediators and the microspheres uptake by peritoneal macrophages. To assess the preservation of the biological activities of these mediators, we conducted intravital microscopy studies and determined the effect of LTB4 and PGE2-loaded biodegradable microspheres on inflammatory mediators release by murine peritoneal macrophages and human endothelial cells. In mice infected by H. capsulatum, we investigated the effects of intranasal administration of the microspheres on pulmonary inflammatory response. In this context, we analyzed the inflammatory cells recruited to the bronchoalveolar space, the mice survival and the number of CFUs recovered from the lungs after the administrations. We also assessed the cytokines release by the lung cells after the treatment with microspheres during the course of the infection. In conclusion, our findings showed that biodegradable microspheres could preserve the biological activity of the encapsulated mediators indicating their use as a new strategy to modulate cell activation, especially in the innate immune response

Studies about the effects of the in vivo administration of Leukotriene B4 or Prostaglandin E2-loaded biodegradable microspheres on model of murine histoplasmosis

Leucotrienos e prostaglandinas são metabólitos do ácido araquidônico que, além de mediadores da inflamação são importantes imunomoduladores da liberação de citocinas, nas respostas imune inata e adquirida. Embora estes mediadores apresentem potencial para serem utilizados como adjuvantes ou imunomoduladores da resposta imune, eles são altamente instáveis, dificultando o uso in vivo. Por esta razão, estas substâncias foram incorporadas em um sistema polimérico microestruturado. Este foi constituído de microesferas de quatro a seis micrômetros de diâmetro, contendo leucotrieno B4 (LTB4) ou prostaglandina E2 (PGE2) incorporados na matriz polimérica (PLGA). A caracterização in vitro das microesferas de PLGA, contendo LTB4 ou PGE2, foi feita através da determinação da morfologia e medida dos diâmetros médios, taxa de encapsulação e perfil de liberação in vitro dos mediadores. Além disso, foi avaliada a preservação da atividade biológica do LTB4 liberado das microesferas, através do efeito do mesmo sobre a expressão de moléculas de adesão Mac-1 por citometria de fluxo. Também foram avaliadas a preservação da atividade biológica do LTB4 e da PGE2 liberados do interior das microesferas, através de estudos com microscopia intravital e a ativação de células endoteliais humanas (HUVECs e HUAECs). Realizamos ainda, ensaio de fagocitose com as microesferas contendo os dois mediadores encapsulados, utilizando macrófagos peritoneais murinos, além da avaliação da sobrevivência dos animais tratados intranasalmente com microesferas contendo LTB4 ou PGE2 durante a infecção pelo H. capulatum. Nestes animais, avaliamos a reação inflamatória pulmonar, o número de UFCs recuperadas dos pulmões e a modulação da resposta imune, através da quantificação de citocinas inflamatórias. Os estudos abordados neste trabalho revelaram achados interessantes e importantes quanto ao uso de microesferas biodegradáveis contendo mediadores lipídicos em situação de terapia, especialmente quando estes estão envolvidos em processos inflamatórios e/ou infecciosos.Leukotrienes and prostaglandins are arachidonic acid metabolites, which participate in the inflammatory response and modulate cytokines release in both adaptive and innate immune responses. However, some physicochemical characteristics of these mediators, such as poor solubility in water and chemical instability, make them difficult to administer in vivo. In this sudy, we developed a polymeric microparticulate system for the encapsulation of lipid mediators. Regarding the in vitro characterization of the microspheres, we determined their diameters, evaluated the in vitro release of the mediators and the microspheres uptake by peritoneal macrophages. To assess the preservation of the biological activities of these mediators, we conducted intravital microscopy studies and determined the effect of LTB4 and PGE2-loaded biodegradable microspheres on inflammatory mediators release by murine peritoneal macrophages and human endothelial cells. In mice infected by H. capsulatum, we investigated the effects of intranasal administration of the microspheres on pulmonary inflammatory response. In this context, we analyzed the inflammatory cells recruited to the bronchoalveolar space, the mice survival and the number of CFUs recovered from the lungs after the administrations. We also assessed the cytokines release by the lung cells after the treatment with microspheres during the course of the infection. In conclusion, our findings showed that biodegradable microspheres could preserve the biological activity of the encapsulated mediators indicating their use as a new strategy to modulate cell activation, especially in the innate immune response

Correlation between TH1 response standard cytokines as biomarkers in patients with the delta virus in the western Brazilian Amazon

Hepatitis D virus (HDV) is endemic in the Amazon Region and its pathophysiology is the most severe among viral hepatitis. Treatment is performed with pegylated interferon and the immune response appears to be important for infection control. HDV patients were studied: untreated and polymerase chain reaction (PCR) positive (n = 9), anti-HDV positive and PCR negative (n = 8), and responders to treatment (n = 12). The cytokines, interleukin (IL)-2 (p = 0.0008) and IL-12 (p = 0.02) were differentially expressed among the groups and were also correlated (p = 0.0143). Future studies will be conducted with patients at different stages of treatment, associating the viral load with serum cytokines produced, thereby attempting to establish a prognostic indicator of the infection