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Développement d'un systÚme double hybride de mammifÚre pour trouver de nouvelles protéines interagissant avec CIITA
Les molĂ©cules du CMH de classe II sont cruciales pour le bon fonctionnement du systĂšme immunitaire. Leur rĂŽle est de prĂ©senter les antigĂšnes provenant de pathogĂšnes aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ et de permettre ainsi la rĂ©ponse immunitaire. Leur expression est principalement rĂ©gulĂ©e au niveau transcriptionnel par le transactivateur CIITA (CMHII transactivator). CIITA est un rĂ©gulateur particulier car il possĂšde un domaine dâactivation de la transcription, mais ne dispose pas de domaine de liaison Ă lâADN. Ainsi, pour activer la transcription, CIITA doit interagir avec plusieurs autres protĂ©ines qui sont fixĂ©es au niveau du promoteur des CMHII. Il possĂšde Ă©galement une rĂ©gion de liaison Ă la GTP et des domaines rĂ©pĂ©tĂ©s riches en leucines (LRR pour « leucine rich repeats ») en c-terminal connues comme Ă©tant importants pour les interactions protĂ©iques. Pour mieux Ă©tudier lâimportance de ces diffĂ©rents domaines pour les fonctions transactivatrices, plusieurs diffĂ©rents mutants de CIITA ont Ă©tĂ© gĂ©nĂ©rĂ©s. De nombreuses Ă©tudes ont aussi tentĂ© dâexpliquer la localisation nuclĂ©ocytoplasmique de CIITA et de lâinter relier aux fonctions transactivatrices. MalgrĂ© tout, le mĂ©canisme dâimportation au noyau de CIITA ainsi que son mode de transactivation ne sont pas totalement dĂ©mystifiĂ©s. Il est connu que les interactions protĂ©ine-protĂ©ine jouent un rĂŽle important dans les mĂ©canismes cellulaires. CIITA est dĂ©pendant de ce type dâinteraction pour activer la transcription des CMHII. Aussi, plusieurs indices suggĂšrent la prĂ©sence de partenaires encore inconnus et par systĂšme double hybride de levure, quelques laboratoires ont tentĂ© de les trouver, mais sans succĂšs. Il est connu que certaines interactions protĂ©iques peuvent passer inaperçues dans ce systĂšme et il est probable que cet Ă©chec est plutĂŽt dĂ» Ă la technique de criblage plutĂŽt quâĂ lâabsence de protĂ©ine dâinteraction. Dans ce projet, un systĂšme double hybride de mammifĂšre se basant sur celui chez la levure a donc Ă©tĂ© dĂ©veloppĂ© et utilisĂ© pour tenter de trouver les partenaires inconnus de CIITA. Le systĂšme dĂ©veloppĂ© utilise un appĂąt couplĂ© Ă un domaine de liaison Ă lâADN (GAL4DBD pour âDNA binding domainâ) et une proie couplĂ©e Ă un domaine dâactivation de la transcription (VP16). CIITA sans son domaine dâactivation et couplĂ© Ă Gal4DBD constitue « lâappĂąt ». La « proie » est une banque dâADN complĂ©mentaire de Raji liĂ©e au domaine VP16. De plus, pour repĂ©rer et tester de nouvelles interactions protĂ©iques avec CIITA, quelques constructions de CIITA manquant certains domaines et couplĂ© Ă Gal4DBD ont Ă©tĂ© fabriquĂ©es. Ensuite, la cassette dâexpression des gĂšnes rapporteurs a Ă©tĂ© intĂ©grĂ©e au gĂ©nome de la lignĂ©e cellulaire RJ 2.2.5 (Lymphome de Burkitt) en utilisant une adaptation du systĂšme Flp-Inâą dâInvitrogen. Cette nouvelle lignĂ©e a Ă©tĂ© nommĂ©e RjFlp-casset. GrĂące au promoteur synthĂ©tique Gal4 de la cassette dâexpression, lorsque lâappĂąt et la proie interagissent, VP16 active la transcription des gĂšnes rapporteurs CD8aâ et blasticidineR. Ensuite, les cellules ont Ă©tĂ© sĂ©lectionnĂ©es par tri cellulaire en utilisant des billes magnĂ©tiques et/ou traitement Ă la blasticidine ou Ă la puromycine (gĂšne de rĂ©sistance sur le vecteur proie). Toutes les combinaisons de traitements ont Ă©tĂ© utilisĂ©es. LâADN Ă©pisomale des cellules oĂč les gĂšnes rapporteurs sâexprimaient a Ă©tĂ© extrait et amplifiĂ© dans E. coli pour ĂȘtre ensuite analysĂ© sur gel dâagarose. Plusieurs rondes de transfection/sĂ©lection/extraction/retransfection ont Ă©tĂ© faites. Malheureusement, aprĂšs plusieurs mois de criblage, aucune nouvelle interaction impliquant CIITA nâa Ă©tĂ© dĂ©couverte. Quelques modifications et perfectionnements de la stratĂ©gie semblent ĂȘtre nĂ©cessaires. Par exemple, dĂ©velopper une lignĂ© cellulaire RjFlp-casset avec en plus lâappĂąt intĂ©grĂ© au gĂ©nome augmenterait les chances de rĂ©ussite par la prĂ©sence constitutive de lâappĂąt.[Symboles non conformes
Développement d'un systÚme double hybride de mammifÚre pour trouver de nouvelles protéines interagissant avec CIITA
Les molĂ©cules du CMH de classe II sont cruciales pour le bon fonctionnement du systĂšme immunitaire. Leur rĂŽle est de prĂ©senter les antigĂšnes provenant de pathogĂšnes aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ et de permettre ainsi la rĂ©ponse immunitaire. Leur expression est principalement rĂ©gulĂ©e au niveau transcriptionnel par le transactivateur CIITA (CMHII transactivator). CIITA est un rĂ©gulateur particulier car il possĂšde un domaine dâactivation de la transcription, mais ne dispose pas de domaine de liaison Ă lâADN. Ainsi, pour activer la transcription, CIITA doit interagir avec plusieurs autres protĂ©ines qui sont fixĂ©es au niveau du promoteur des CMHII. Il possĂšde Ă©galement une rĂ©gion de liaison Ă la GTP et des domaines rĂ©pĂ©tĂ©s riches en leucines (LRR pour « leucine rich repeats ») en c-terminal connues comme Ă©tant importants pour les interactions protĂ©iques. Pour mieux Ă©tudier lâimportance de ces diffĂ©rents domaines pour les fonctions transactivatrices, plusieurs diffĂ©rents mutants de CIITA ont Ă©tĂ© gĂ©nĂ©rĂ©s. De nombreuses Ă©tudes ont aussi tentĂ© dâexpliquer la localisation nuclĂ©ocytoplasmique de CIITA et de lâinter relier aux fonctions transactivatrices. MalgrĂ© tout, le mĂ©canisme dâimportation au noyau de CIITA ainsi que son mode de transactivation ne sont pas totalement dĂ©mystifiĂ©s. Il est connu que les interactions protĂ©ine-protĂ©ine jouent un rĂŽle important dans les mĂ©canismes cellulaires. CIITA est dĂ©pendant de ce type dâinteraction pour activer la transcription des CMHII. Aussi, plusieurs indices suggĂšrent la prĂ©sence de partenaires encore inconnus et par systĂšme double hybride de levure, quelques laboratoires ont tentĂ© de les trouver, mais sans succĂšs. Il est connu que certaines interactions protĂ©iques peuvent passer inaperçues dans ce systĂšme et il est probable que cet Ă©chec est plutĂŽt dĂ» Ă la technique de criblage plutĂŽt quâĂ lâabsence de protĂ©ine dâinteraction. Dans ce projet, un systĂšme double hybride de mammifĂšre se basant sur celui chez la levure a donc Ă©tĂ© dĂ©veloppĂ© et utilisĂ© pour tenter de trouver les partenaires inconnus de CIITA. Le systĂšme dĂ©veloppĂ© utilise un appĂąt couplĂ© Ă un domaine de liaison Ă lâADN (GAL4DBD pour âDNA binding domainâ) et une proie couplĂ©e Ă un domaine dâactivation de la transcription (VP16). CIITA sans son domaine dâactivation et couplĂ© Ă Gal4DBD constitue « lâappĂąt ». La « proie » est une banque dâADN complĂ©mentaire de Raji liĂ©e au domaine VP16. De plus, pour repĂ©rer et tester de nouvelles interactions protĂ©iques avec CIITA, quelques constructions de CIITA manquant certains domaines et couplĂ© Ă Gal4DBD ont Ă©tĂ© fabriquĂ©es. Ensuite, la cassette dâexpression des gĂšnes rapporteurs a Ă©tĂ© intĂ©grĂ©e au gĂ©nome de la lignĂ©e cellulaire RJ 2.2.5 (Lymphome de Burkitt) en utilisant une adaptation du systĂšme Flp-Inâą dâInvitrogen. Cette nouvelle lignĂ©e a Ă©tĂ© nommĂ©e RjFlp-casset. GrĂące au promoteur synthĂ©tique Gal4 de la cassette dâexpression, lorsque lâappĂąt et la proie interagissent, VP16 active la transcription des gĂšnes rapporteurs CD8aâ et blasticidineR. Ensuite, les cellules ont Ă©tĂ© sĂ©lectionnĂ©es par tri cellulaire en utilisant des billes magnĂ©tiques et/ou traitement Ă la blasticidine ou Ă la puromycine (gĂšne de rĂ©sistance sur le vecteur proie). Toutes les combinaisons de traitements ont Ă©tĂ© utilisĂ©es. LâADN Ă©pisomale des cellules oĂč les gĂšnes rapporteurs sâexprimaient a Ă©tĂ© extrait et amplifiĂ© dans E. coli pour ĂȘtre ensuite analysĂ© sur gel dâagarose. Plusieurs rondes de transfection/sĂ©lection/extraction/retransfection ont Ă©tĂ© faites. Malheureusement, aprĂšs plusieurs mois de criblage, aucune nouvelle interaction impliquant CIITA nâa Ă©tĂ© dĂ©couverte. Quelques modifications et perfectionnements de la stratĂ©gie semblent ĂȘtre nĂ©cessaires. Par exemple, dĂ©velopper une lignĂ© cellulaire RjFlp-casset avec en plus lâappĂąt intĂ©grĂ© au gĂ©nome augmenterait les chances de rĂ©ussite par la prĂ©sence constitutive de lâappĂąt.[Symboles non conformes
Permanent genetic resources added to molecular ecology resources database 1 june 2011â31 july 2011
3 pagesInternational audienceThis article documents the addition of 112 microsatellite marker loci and 24 pairs of single nucleotide polymorphism (SNP) sequencing primers to the Molecular Ecology Resources Database. Loci were developed for the following species: Agelaius phoeniceus, Austrolittorina cincta, Circus cyaneus, Circus macrourus, Circus pygargus, CryptocoryneâĂâpurpurea Ridl. nothovar. purpurea, Mya arenaria, Patagioenas squamosa, Prochilodus mariae, Scylla serrata and Scytalopus speluncae. These loci were cross-tested on the following species: CryptocoryneâĂâpurpurea nothovar. purpurea, Cryptocoryne affinis, Cryptocoryne ciliata, Cryptocoryne cordata var. cordata, Cryptocoryne elliptica, Cryptocoryne griffithii, Cryptocoryne minima, Cryptocoryne nurii and Cryptocoryne schulzei. This article also documents the addition of 24 sequencing primer pairs and 24 allele-specific primers or probes for Aphis glycines
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Comparative performances of machine learning methods for classifying Crohn Disease patients using genome-wide genotyping data
Abstract: Crohn Disease (CD) is a complex genetic disorder for which more than 140 genes have been identified using genome wide association studies (GWAS). However, the genetic architecture of the trait remains largely unknown. The recent development of machine learning (ML) approaches incited us to apply them to classify healthy and diseased people according to their genomic information. The Immunochip dataset containing 18,227 CD patients and 34,050 healthy controls enrolled and genotyped by the international Inflammatory Bowel Disease genetic consortium (IIBDGC) has been re-analyzed using a set of ML methods: penalized logistic regression (LR), gradient boosted trees (GBT) and artificial neural networks (NN). The main score used to compare the methods was the Area Under the ROC Curve (AUC) statistics. The impact of quality control (QC), imputing and coding methods on LR results showed that QC methods and imputation of missing genotypes may artificially increase the scores. At the opposite, neither the patient/control ratio nor marker preselection or coding strategies significantly affected the results. LR methods, including Lasso, Ridge and ElasticNet provided similar results with a maximum AUC of 0.80. GBT methods like XGBoost, LightGBM and CatBoost, together with dense NN with one or more hidden layers, provided similar AUC values, suggesting limited epistatic effects in the genetic architecture of the trait. ML methods detected near all the genetic variants previously identified by GWAS among the best predictors plus additional predictors with lower effects. The robustness and complementarity of the different methods are also studied. Compared to LR, non-linear models such as GBT or NN may provide robust complementary approaches to identify and classify genetic markers