Morphological, biological and molecular characterization of three Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) stains isolated of Triatoma sordida Stal 1859 (Hemiptera, Reduviidae) specimens

Orientador: João Aristeu da RosaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo : A doenca de Chagas, assim como seu agente etiologico Trypanosoma cruzi, foram descritos por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas. T. cruzi e transmitido por hemipteros sendo os generos Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma os mais importantes. Com resultados bastante satisfatorios em relacao ao controle do principal vetor, T. infestans, outros triatomineos de importancia secundaria, coletados no peridomicilio, passaram a assumir maior relevancia, dentre essas especies, T. sordida. As populacoes de T. cruzi apresentam grande variabilidade intraespecifica evidenciada por diferencas na morfologia, na virulencia e patogenicidade, na habilidade de evasao a resposta imune do hospedeiro e na constituicao antigenica. Essa diversidade pode estar associada a sua adaptacao e sobrevivencia em diferentes hospedeiros. As diferentes formas de manifestacao clinica da doenca no homem podem ser associadas com cepas especificas ou com marcadores geneticos do hospedeiro, embora ambos possam influenciar o curso da infeccao. Este trabalho objetivou a caracterizacao biologica, morfologica e molecular de tres cepas de T. cruzi (SI5, SI8 e SIGR3) isoladas de T. sordida coletadas em Santo Inacio, Bahia. Desse modo, o estudo biologico indicou que as cepas isoladas de Santo Inacio, pertencem ao Biodema III e Zimodema I. Os resultados das mensuracoes das cepas SI5, SI8 e SIGR3 mostraram polimorfismo das formas tripomastigotas sanguineas, embora com predominancia de formas intermediarias para largura do corpo e curtas para comprimento total do corpo no decurso da infeccao experimental. Foram avaliados para as formas epimastigotas, parametros como comprimento total do corpo, largura e indice nuclear e observamos para as cepas SI5, SI8 e SIGR3 respectivamente, formas intermediaria/intermediaria/baixo, curto/intermediario/baixo e curta/larga/baixo para os parametros descritos acima. O significado geral desse polimorfismo ainda nao foi suficientemente investigado, desconhecendo-se se ele expressa um diferente comportamento biologico das cepas ou se reflete apenas a existencia de um "complexo" morfologico. A caracterizacao molecular das cepas SI5, SI8 e SIGR3, as enquadram no grupo II, o que indica, que nesse local circula uma mesma linhagem de T. cruzi, apesar das mesmas terem sido isoladas de hospedeiros e epocas distintas.Abstract: Chagas disease and its causative agent Trypanosoma cruzi were described by Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas. T. cruzi is transmitted by blood-sucking hemipterous and Panstrongylus, Rhodnius and Triatoma are the most important genera. Satisfactory results were achieved to the control of the main vector, T. infestans. However, other bugs of secondary importance, like Triatoma sordida collected around the houses began to assume greater epidemiological importance. The populations of T. cruzi show great variability among individuals demonstrated by differences in morphology, virulence and pathogenicity, ability to evade the host immune response and antigenic constitution. Such diversity may be associated with their adaptation and survival in different hosts. The course of the infection in human may be associated with specific strains or host genetic markers, although both can influence. This aim of this study was the biological, morphological and molecular characterization of three strains of T. cruzi (SI5, and SI8 SIGR3) isolated from T. sordida collected in Santo Inacio, Bahia. The biological study indicated that the isolates from Santo Inacio, belong to Biodeme III Zimodeme I. The results of measurements of the strains SI5, SI8 SIGR3 showed polymorphism of blood trypomastigotes, with a predominance of intermediate forms to body width and short length for total body in the course of experimental infection. Parameters such as: total body length, width and nuclear index were evaluated for epimastigotes, and observed for strains SI5, SI8 and SIGR3 respectively, forms na intermediate / middle / low, short / intermediate / low, short / wide / low for the parameters described above. The general meaning of this polymorphism has not been sufficiently investigated. It is not known if such poliymorphism expresses a different biologic behavior of the strains or merely is a result of a "complex" morphology. According to the molecular characterization the strains SI5, SI8 SIGR3 are in group II, which indicates that in this site it occurs the same lineage of T. cruzi, despite their different sources (isolated from different hosts and different times).MestradoParasitologiaMestre em Parasitologi

Biological and molecular characterization of strains of Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) isolated from Bahia, Rio Grande do Sul, Santa Catarina and São Paulo

Orientadores: João Aristeu da Rosa, Mário SteindelTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Trypanosoma cruzi, protozoário que faz parte da família Trypanosomatidae é o agente causador da doença de Chagas que afeta 6-8 milhões de pessoas na América Latina. A origem dessa família pode ser estudada por meio de técnicas moleculares, como a investigação da região V7V8 - SSUrRNA. Trypanosoma cruzi é subdividido em seis grupos independentes TcI-TcVI denominados Unidades Discretas de Tipagem (DTUs). A caracterização biológica e molecular de onze cepas de T. cruzi pertencentes aos grupos TcI (Bolívia; Tlenti; Tmelanocephala; SC90), TcII (Famema; SC96; SI8; Y) e TcIII (QMM3; QMM5; SI5) isoladas de cinco espécies de triatomíneos esclarece fatores biológicos por parâmetros como a cinética de crescimento, curva parasitêmica, taxa de infeção celular, caracterização molecular, ação de metaloproteinases, perfil protéico e sorologia. O objetivo do trabalho foi a caracterização biológica e molecular de cepas de T. cruzi isoladas de triatomíneos da Bahia, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo. O grupo TcII de T. cruzi mostrou maior capacidade multiplicativa em formas epimastigotas durante a cinética de crescimento, seguido por TcI e TcIII. A curva parasitêmica evidenciou variabilidade entre os camundongos Balb/c, contudo ao comparar os grupos TcI, TcII e TcIII de T. cruzi o perfil parasitêmico mostrou-se equivalente. Acrescentando os dados biológicos estudou-se a taxa de infecção de T. cruzi em linhagens celulares J774 e macrófagos peritoneais. O grupo TcI de T. cruzi apresentou maior taxa de infecção e menor tempo exigido para a multiplicação de formas amastigotas, assim como macrófagos peritoneias mostraram-se mais atrativos para T. cruzi. A caracterização molecular, por meio da região V7V8, mostrou que essas cepas pertencem às DTUs TcI, TcII e TcIII. A separação dos grupos torna-se evidente ao comparar o perfil protéico em formas epi e tripomastigotas de T. cruzi. O grupo TcI apresentou mais proteínas nos géis de acrilamida, particularidade que pode ser associada a intra-específicidade de TcI. A ação de metaloproteinases foi observada em formas epi e tripomastigotas sugerindo presença ativa e estável durante parte do ciclo do parasito. A reatividade sorológica foi comprovada nos grupos TcI, TcII e TcIII, por meio de ELISA em diluições de 1/100 até 1/12.800. A adição da técnica de Western Blotting aos ensaios por SDS-PAGE em soros de animais infectados após 50 dias mostrou o perfil protéico da cepa Y em membrana de nitrocelulose. Em conjunto, os resultados mostraram que as onze cepas de T. cruzi apresentaram diferenças entre os grupos do parasito. O grupo TcI mostrou maior taxa de infecção em células; TcII, os maiores valores para a cinética de crescimento e TcIII filogenéticamente próximo a TcV, grupo híbrido. A associação parasito-hospedeiro pode explicar diferenças biológicas e moleculares em cepas de T. cruzi, neste sentido o estudo de onze cepas isoladas de diferentes hospedeiros pode agregar informações a literatura e esclarecer alguns aspectos biológicos desse patógenoAbstract: Trypanosoma cruzi, a protozoan from the family Trypanosomatidae, is responsible for Chagas disease which affects about 6 to 8 million people in Latin America. The origin of this family can be studied through molecular techniques, for instance the investigation of the region V7V8 ¿ SSurRNA. The protozoan is subdivided in six independents groups TcI-TcVI known as Discrete Typing of Units (DTUs). The biological and molecular characterization of eleven strains of T. cruzi from the group TcI (Bolivia; Tlenti; Tmelanocephala; SC90), TcII (Famema; SC96; SI8; Y) and TcIII (QMM3; QMM5; SI5) isolated from five different species of triatomine are able to elucidate biological factors through the kinetic growth, parasitemic curve, cell infection rate, molecular characterization, metalloproteinase action, proteic and serological profile. This investigation was conducted to provide a biological and molecular characterization of T. cruzi isolated from specimens of triatomines. The group TcII of T. cruzi demonstrated higher replicative capacity in epimastigotes forms during the kinetic growth curve, followed by TcI and TcIII. The parasitemic curve demonstrated variability between Balb/c mice; however, the groups TcI, TcII and TcIII showed equivalent parasitemic profile. Furthermore, the cell infection rate in J774 cellular lineages and peritoneal macrophages was used to corroborate the biological data. The group TcI of T. cruzi demonstrated higher infection rate and less time to amastigotes forms multiplication and the peritoneal macrophages showed more attractive to T. cruzi. The molecular characterization through the V7V8 region indicated that these strains belong to DTUs TcI, TcII and TcIII. The groups segregation is important to compare the proteic profile of epimastigotes and tripomastigotes forms of T. cruzi. The groups TcI presented more proteins in acrylamide gels, which can be associated with intra-specif of TcI. The metalloproteinase action was observed in epimastigotes and tripomastigotes forms, demonstrating active and stable presence at the parasite life cycle. The serological reactivity was proven in the groups TcI, TcII and TcIII through ELISA dilutions of 1/100 to 1/12.800. Moreover, the Western Blotting technique was added to SDS-PAGE experiments in infected animals¿ serum after 50 dias and the proteic profile of Y strain was observed in nitrocellulose membrane. The results demonstrated that these eleven strains of T. cruzi have differences between the groups of the parasite. The group TcI showed higher infection rate in cells; TcII, higher value for kinetic growth and TcIII is phylogenetically closer to TcV, which is a hybrid group. The association between parasite and host is able to explain the biological and molecular differences in T. cruzi strains; for this reason, the study of eleven strains isolated from different hosts can add information to the literature and clarify some of the biological aspects of the parasiteDoutoradoParasitologiaDoutora em Parasitologi