Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding

We are grateful for funding from Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (SFRH/BD/41884/2007), Human Frontier Science Program (RGP/2007), and European Research Council (2007-StG-208631).Epithelial wound healing relies on tissue movements and cell shape changes. Our work shows that, immediately after wounding, there was a dramatic cytoskeleton remodeling consisting of a pulse of actomyosin filaments that assembled in cells around the wound edge and flowed from cell to cell toward the margin of the wound. We show that this actomyosin flow was regulated by Diaphanous and ROCK and that it elicited a wave of apical cell constriction that culminated in the formation of the leading edge actomyosin cable, a structure that is essential for wound closure. Calcium signaling played an important role in this process, as its intracellular concentration increased dramatically immediately after wounding, and down-regulation of transient receptor potential channel M, a stress-activated calcium channel, also impaired solin, protein, also impaired the wound response, indicating that cleaving the existing actin filament network is an important part of the cytoskeleton remodeling process.publishersversionpublishe

Characterization of tissue mechanics and cell cycle during wound healing : when software meets biology

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017Wound healing is essential to all living organisms. All organisms need robust mechanisms to overcome injury, starting from a single cell wound to large chronic wounds in the human skin. Inflammation processes, tissue movement and proliferation along with tissue remodeling are critical in order to close and restore what once was a tissue discontinuity. All these events need to be extremely well regulated and coordinated: if one step fails wound healing may be compromised. The way all these processes are interconnected and how tissues activate the needed repair mechanisms is not yet fully understood. Our aim was to address how tissue mechanics affects wound healing and how the cell cycle is regulated during this process in the context of a living organism – in this case Drosophila melanogaster. To study these mechanisms in vivo, advanced imaging techniques are required, thus our first aim was to design new software tools to facilitate processing and analysis of the large amounts of data that are generated. On this note, we developed three open source software Matlab™ toolboxes that are easy to use and work fast: PIVBio allows us to successfully track wound closure movements without segmentation making it a perfect tool for a global analysis of cellular behaviors; CellSeg is a modular and integrated segmentation and analysis toolbox that, by implementing a new segmentation algorithm, helped us getting new insights on a novel phenomenon on the initial stages of wound healing, the actin flow; and CellDivTracker_fucciEdition that allows us to track cell division at single or whole tissue level over time. Additionally, the latter was successfully employed as a screen scoring tool that has proven to be useful to uncover new links between the cell cycle and wound healing. Our next aim was to understand how tissues responded mechanically to the wound insult. Upon detailed analysis of all the gathered data, we revealed that the edge curvature plays a fundamental role in the way the wounds close and in determining where cells assemble the actomyosin cable and filopodia and lamellipodia. To further analyze this discovery, we built a mathematical model taking into account all the previous knowledge. This model allowed us to understand what are the physical properties of the tissue that contribute significantly to wound closure in the Drosophila notum epithelium. We found that viscosity was the dominant property in the Drosophila tissue in detriment of a friction dominant tissue. This implies that cell migration and movement depends more on cell-cell interactions than on cell-substrate interactions, and thus shows that cell-cell adhesion complexes play a crucial role in wound closure in vivo. We took the model one step further by using it to investigate the role of myosin regulators on the tissue properties and wound closure. The model allowed us to understand that Stretchin-MLCK downregulates the actomyosin cable, which corresponds to a lower cable tension. Despite this tension loss, filopodia and lamellipodia are able to compensate for this deficiency in the actomyosin cable, albeit by engaging a different geometry. The third goal of this thesis was to investigate how the cell cycle is regulated and coordinated with the wound closure process. Interestingly, we found that the cells that surround the wound temporarily arrest at the G2 phase of the cell cycle, only resuming cell division after the wound has successfully closed. This type of arrest has not been described before and is accompanied by misregulation of key cell cycle players, such as Cyclin B, Cdc25 and chromatin condensation. Finally, we identified novel pathways that link the cell cycle arrest to the cellular behaviors occurring during wound healing, namely the Toll/NF-kB pathway, by performing a screen. Strikingly, when this pathway is knocked down, cells at the wound edge overcome the typical cell cycle arrest, dividing faster than wild type cells. Together, our novel software tools helped us to uncover new biological mechanisms by using new algorithms for data extraction and analysis. Additionally, the novel mathematical model developed revealed that the wound edge curvature gives an important contribution to wound closure and deepened our understanding of how the tissue and cells interact at a global level. Finally, we identified a new link between wound closure and the cell cycle: The Toll pathway. This unexpected connection has both expanded our knowledge and raised new and challenging questions that will be worth to explore in the future.A cicatrização de feridas é um processo essencial para todos os organismos vivos. Desde feridas ao nível de uma célula a grandes feridas crónicas na pele humana, todos os organismos necessitam de mecanismos robustos para superar lesões. Processos inflamatórios, migração de tecidos e proliferação celular, juntamente com remodelação de tecidos são críticos para reparar uma descontinuidade do tecido. Todos estes eventos têm de ser muito bem regulados e coordenados: basta um passo falhar para a cicatrização de uma ferida ser comprometida. Infelizmente, apesar de todos os estudos que têm identificado várias vias de sinalização importantes, a forma como todos estes processos estão interligados e como os tecidos ativam os mecanismos de reparação ainda não é totalmente compreendida. O objetivo desta tese foi então abordar como é que a mecânica dos tecidos pode afetar a cicatrização de feridas e como é que o ciclo celular é regulado durante este processo num contexto in vivo, neste caso, utilizando o modelo Drosophila melanogaster. Para estudar esses mecanismos celulares num organismo vivo, técnicas de microscopia avançadas são essenciais, portanto, o nosso primeiro objetivo foi conceber novas ferramentas de software para facilitar o processamento e análise de grandes quantidades de dados que são geradas. Desta forma, utilizando a linguagem Matlab™, desenvolvemos três ferramentas de software de código aberto que são rápidas e fáceis de usar: 1) PIVBio permite-nos seguir os movimentos de fecho da ferida sem haver a necessidade de segmentação das imagens, o que a torna uma ferramenta perfeita para uma análise global de comportamentos celulares; 2) CellSeg é uma ferramenta modular de segmentação e análise que, através da implementação de um novo algoritmo de segmentação, nos ajudou a obter novas ideias sobre um novo fenómeno que ocorre nas fases iniciais da cicatrização de feridas, o fluxo de actina; e 3) CellDivTracker_fucciEdition, que nos permite seguir a divisão celular ao nível da célula ou do tecido ao longo do tempo. Além disso, este último instrumento foi utilizado com sucesso num estudo genético de larga escala que provou ser útil para descobrir novas ligações entre o ciclo celular e a cicatrização de feridas. O nosso segundo objetivo foi tentar perceber como é que os tecidos respondem mecanicamente a uma ferida. Após uma análise detalhada de todos os dados recolhidos, descobrimos que a curvatura do bordo da ferida desempenha um papel fundamental na forma como as feridas fecham e para determinar o local onde se forma o cabo de actina e miosina e os filopódios e lamelipódios. Para aprofundar a análise desta descoberta, desenhámos um modelo matemático tendo como base todos os conhecimentos anteriores. Este modelo permitiu-nos compreender quais as propriedades físicas do tecido que contribuem mais significativamente para o fecho da ferida no epitélio do notum de Drosophila. Nomeadamente, descobrimos que a viscosidade é a propriedade dominante no epitélio de Drosophila em detrimento da contribuição do atrito. Isto significa que a migração de células depende mais das interações célula-célula do que das interações célula-substrato, e, portanto, mostra que os complexos de adesão célula-célula representam um papel crucial no fecho de feridas in vivo. Em seguida, levámos o modelo um pouco mais longe, usando-o para investigar a função dos reguladores de miosina na regulação das propriedades físicas do tecido epitelial e do fecho da ferida. Este modelo mostrou-nos que o regulador de miosina Stretchin-MLCK regula negativamente o cabo de actina e miosina, reduzindo a sua tensão. Apesar desta perda de tensão, os filopódios e os lamelipódios conseguem compensar esta deficiência no cabo de actina e miosina, apesar de o fazer com uma geometria diferente. O terceiro objetivo desta tese foi investigar como é que o ciclo celular é regulado e como é que este se coordena com o fecho da ferida. Curiosamente, verificámos que as células que circundam a ferida respondem de uma forma original: detêm-se temporariamente na fase G2 do ciclo celular, apenas retomando a divisão celular após a ferida ter fechado com sucesso. Mostrámos ainda que este mecanismo é acompanhado pela desregulação de moléculas e processos-chave para o ciclo celular, como a Ciclina B, a Cdc25 e a condensação de cromatina. Por último, através da realização de um estudo genético, foram identificadas novas vias de sinalização que ligam este atraso no ciclo celular com os comportamentos celulares que ocorrem durante o fecho de feridas, em particular a via Toll/NF-kB. Surpreendentemente, quando se interfere com a função desta via, as células do bordo da ferida conseguem superar a paragem no ciclo celular, dividindo-se mais cedo do que as células normais (selvagens). Concluindo, as novas ferramentas de software que criámos ajudaram-nos a descobrir novos mecanismos biológicos através da aplicação de novos algoritmos para a extração e a análise de dados. Além disso, o novo modelo matemático que desenvolvemos revelou-nos que a curvatura da borda da ferida dá uma contribuição importante para o fecho da ferida e aprofundou o nosso conhecimento de como as células epiteliais interagem ao nível do tecido. Finalmente, conseguimos identificar uma via de sinalização que estabelece a ponte entre o fecho da ferida e o ciclo celular: a via Toll. Além de expandir o nosso conhecimento, esta nova ligação levanta também novas questões interessantes e desafiantes que irão certamente ser exploradas no futuro