O silenciamento da quinase humana Nek1 altera a resposta a danos ao DNA induzidos por agente indutor de crosslinks

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte.Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death

Estudo do envolvimento da cinase humana Nek1 na sinalização de reparo de DNA

As Nek são proteínas cinases humanas evolutivamente conservadas e estruturalmente relacionadas à NIMA, um regulador mitótico descrito em Aspergillus nidulans. A Nek1, uma das onze isoformas das Neks identificadas em mamíferos, parece estar envolvida na etiologia da Doença Policística do Rim (PKD) em humanos, pois sua deleção em animais causa uma síndrome semelhante à PKD. Além disso, existem evidências sobre sua participação no reparo ao DNA em resposta à radiação ionizante e sobre sua interação com proteínas envolvidas em rotas de reparo e na regulação do ciclo celular de mamífero, mas pouco se sabe sobre seu papel na fisiologia das células de mamíferos. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da Nek1 no reparo de DNA. A sensibilidade dae linhagens celulares aos agentes genotóxicos foram testados pelo ensaio cometa em pH alcalino e também por meio do ensaio de proliferação celular MTT. Para isso, utilizamos a linhagem de rim Hek293t e de glioma humano U87. Essas células foram silenciadas através de um sistema lentiviral estável que usa a proteína fluorescente verde (GFP) como marcador. A seleção das linhagens Nek-negativas foi feita por isolamento de colônias GFP-positivas. As células utilizadas como controle nesse trabalho também expressavam GFP além da Nek1. As células foram testadas com os agentes indutores de danos ao DNA metil-metanosulfonato, peróxido de hidrogênio e cisplatina. Os resultados mostraram o retardo no reparo de células silenciadas tratadas com peróxido de hidrogênio e metil-metanosulfonato. Após o tratamento com cisplatina, o DNA das células silenciadas apresentou um padrão de migração diferente, característico de lesões do tipo ligações cruzadas (crosslink). Esse aspecto permaneceu até 4 horas após a exposição à cisplatina, quando o aspecto de cauda começou a tornar-se mais predominante entre as células observadas. Nosso estudo também mostrou maior sensibilidade da linhagem silenciada em relação à selvagem quando tratadas com esses três agentes por 24, 48 e 72 h de tratamento. Portanto, nossos resultados indicam que a ausência da Nek1 provoca alterações no reparo normal de danos ao DNA e aumento da sensibilidade ao estresse genotóxico, mas aparentemente ela não é essencial para a sinalização do reparo, uma vez que, mesmo com o retardo, as células acabam conseguindo reparar o dano causado. Esses efeitos podem estar ocorrendo devido a uma deficiência nas vias de reparo de quebras no DNA que são realizadas por mecanismos de recombinação. Por outro lado, a Nek1 poderia estar atuando no reparo DNA lesado indiretamente através da regulação do ciclo celular, uma vez que a ocorrência de uma lesão no material genético pode alterar o ciclo celular, causando uma parada. Ainda é cedo para afirmar se a Nek1 está atuando diretamente no controle do ciclo celular ou em rotas de reparo ou até mesmo nas duas. Entender como essa proteína funciona in vivo pode auxiliar no estudo da etiologia da Doença Policística do Rim bem como no entendimento de patologias associadas a lesões no material genético.NIMA related kinases (Neks) are evolutionarily conserved proteins structurally related to the Aspergillus nidulans mitotic regulator NIMA. The Nek1, one of the eleven isoforms of the Neks identified in mammals, seems to be involved in the etiology of the polycystic kidney disease (PKD) in humans because the deletion of Nek1 in animals causes a disease like PKD. Moreover, there are evidences about its participation in DNA repair in response to ionizing radiation and about its interaction with proteins involved in routes of repair and the mammals cell cycle regulation, but little is known about its role in the human cells physiology. The aim of this study was evaluating a possible role of Nek1 in the DNA repair. The sensitivity of the lines to genotoxic agents were tested by comet assay in alkaline pH and also by cell proliferation MTT assay of. For this, we used human embryonic kidney Hek293t of and human glioma U87 cell lines. These cells were silenced by a system that uses lentiviral vector with a green fluorescent protein (GFP) as a marker. The selection of the Nek negative cells lines was made by isolation of colonies GFP positive. The cells used as a control in this work also expressed GFP. The cells were treated by hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate and cisplatin. The results showed a delay in the silenced cells repair when treated with hydrogen peroxide and methyl-methanesulphonate. After the treatment with cisplatin, the silenced cells DNA presented a different pattern of migration, typical of the type of crosslink damage. This aspect remained up to 4 hours after exposure to cisplatin, when the appearance of tail began to become predominant in the cells observed. Our study also showed greater silenced line sensitivity to the wild when treated with the three agents by 24, 48 and 72h of treatment. Our results indicate that the Nek1 absence causes changes in the normal DNA damage repair and increased sensitivity to genotoxic stress, but apparently it is not essential for repair signaling because, even with delay, cells still repair the DNA damages. These effects may be occurring due to a deficiency in the process of DNA breaks repair that are held by recombination mechanisms. Meanwhile, Nek1 could be acting in DNA damage repair indirectly through the regulation of the cell cycle, since the occurrence of an injury in the genetic material can change the cell cycle, causing a stop. It is too early to say whether the Nek1 is working directly in the control of cell cycle or in routes for the repair or even in both. Understanding how this protein works in vivo can assist in the study of the etiology of PKD and in the understanding of diseases associated with lesions in the genetic material

O silenciamento da quinase humana Nek1 altera a resposta a danos ao DNA induzidos por agente indutor de crosslinks

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte.Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death

Obtenção da proteína recombinante glutationa s-transferase de Boophilus microplus para cristalografia e ensaio de atividade enzimática

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Obtenção da proteína recombinante glutationa s-transferase de Boophilus microplus para cristalografia e ensaio de atividade enzimática

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Células com a cinase Nek1 silenciada apresentam maior sensibilidade a agentes mutagênicos

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Silenciamento da quinase Nek1 aumenta dano ao DNA em células Hek293T

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Silenciamento da quinase Nek1 aumenta dano ao DNA em células Hek293T

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