Chemerin gene variants association with metabolic parameters in women with polycystic ovary syndrome

Objective: To evaluate Chemerin gene (RARRES2) SNVs rs4721 and rs17173608 association with clinical and biochemical characteristics, also with the metabolic and androgenic condition in women with Polycystic Ovary syndrome (PCOS).Materials and methods: We analyzed 107 women with PCOS according to the Rotterdam criteria (17-38 years). PCOS were divided into subgroups by the presence or absence of metabolicsyndrome (MS) and hyperandrogenism (HA). Peripheral blood genomic DNA was purified and genotyped by T-ARMS PCR (Tetraamplification refractory mutation system for rs 17173608 (RARRES2 NC_000007.14(NM_002889.4):c.280-494A>C) and PCR-RFLP for rs4721 (RARRES2 NM_002889.4):c.*13A>C). Statistical analyzes were performed with GraphPad Prism and SPSS (t-Student test,ANCOVA with p-values adjusted for age and χ2 analysis).Results: The PCOS patients showed a genotype distribution of TT genotype (44.9%), followed by TG genotype (43%) and GG (12.1%) for the rs4721; similar to the frequency found in Caucasians (Hap-MapProject). The population was in Hardy Weinberg equilibrium (x2= 0.147; p = 0.70). The rs17173608 could not be analyzed because of the low presence of the minor allele (4%). Through ANCOVA analysis age adjusted, it was shown that the presence of rs4721G allele was associated with higher levels of total cholesterol/HDL (p=0.04), LDL-c (p=0,02) triglycerides (p=0.03), insulin (p=0.02), HOMA (p=0.04), LAP index (Lipid accumulation product, p=0.03), testosterone (p= 0.08), LH/FSH (p=0.03). Also, rs4721 G allele was associated with larger telomere length (p=0.04) and lesser mitochondrial DNA mass (p=0.08).Conclusion: In women with PCOS, rs4721G allele was associated with worse metabolic and hormonal parameters. In this preliminary study, no association was found between SNV rs4721 Chemerin gene and susceptibility to MS and HA in women with PCOS.Fil: Velazquez, Mariela Edith. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Rojo, Mailen. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; ArgentinaFil: Pautasso, María Constanza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo; ArgentinaFil: Millán, Andrea Liliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo; ArgentinaFil: Abruzzese, Giselle Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Motta, Alicia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; ArgentinaFil: Cerrone, Gloria Edith. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Inmunología, Genética y Metabolismo; ArgentinaLXV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; LXVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología y Reunión Anual de la Sociedad Argentina de FisiologíaVirtualArgentinaSociedad Argentina de Investigación ClínicaSociedad Argentina de InmunologíaSociedad Argentina de Fisiologí

Transcriptional regulation of protein kinase a subunits from Saccharomyces cerevisiae

Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiologíainterna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balanceinterno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad deperturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando deesta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructurascelulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a unainestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener lahomeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalizacióncomplejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en elambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez delambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichosmecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que estáninvolucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés ydiferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares escontrolada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consisteen un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por losgenes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un únicogen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa seencuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario,tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes decarbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación asituaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. Laespecificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por variosfactores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa ydel sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción dela quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. Laregulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo sebuscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de lassubunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificarglobalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en laregulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de losniveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de losgenes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menorde la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben unaactividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorionegativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propiosgenes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, ymediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía derespuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1,interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción ríoabajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y sureclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de larespuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó unmarcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismofermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas queparticipan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar alfactor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 comorepresor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activomediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores detranscripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado deglucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente decarbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducciónde señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente decarbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, serealizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevosreguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuentede carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías queregulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology paradeterminar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a lascategorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo defosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron tambiéngenes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por lospromotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió comoreguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cadasubunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos deinositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de lassubunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos defosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a suvez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad deuna regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estosprocesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además enrelación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulacióninhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de laexpresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega unrol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino deseñalización cAMP-PKA.Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internalphysiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditionscan result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium,and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face ofvariable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensingsystems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptlyvariations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity,acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. Whenenvironmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomicexpression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA)controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer withtwo catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer ofregulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuliactivating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium;while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratorymetabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificityof the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMPconcentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence orabsence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and itssubstrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little isknown about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of thiswork was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of thegenes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including differentcarbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolicpathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. Asa first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels wedetermined that the expression level of PKA subunit promoters is different during thegrowth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 thelowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA,or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatorybehavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmoticstress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simpledeletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed itspresence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in thepresence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a markedincrement in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbonsource signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as arepressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate thepresence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and itsdownstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having animportant role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunitspromoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, andthat the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated inthe regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, wecarried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Arraytechnique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. Thisstudy was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysislet us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the fourpromoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging totranscription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolismaffected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in differentregulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolismwhich affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belongingto categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of theresults pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novelupstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from thiswork we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associatedwith the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocalregulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and theseprocesses would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is inconcordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitoryregulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKAsubunits plays an important role in determining the specificity of the response in thecAMP-PKA signaling transduction pathway.Fil: Pautasso, María Constanza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Transcriptional regulation of protein kinase a subunits from Saccharomyces cerevisiae

Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiología interna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balance interno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad de perturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando de esta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructuras celulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a una inestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener la homeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalización complejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en el ambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez del ambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichos mecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que están involucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés y diferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares es controlada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consiste en un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por los genes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un único gen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa se encuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario, tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes de carbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación a situaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. La especificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por varios factores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa y del sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción de la quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. La regulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo se buscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de las subunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificar globalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en la regulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de los niveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de los genes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menor de la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben una actividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorio negativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propios genes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, y mediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía de respuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1, interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción río abajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y su reclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de la respuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó un marcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismo fermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas que participan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar al factor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 como represor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activo mediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores de transcripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado de glucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente de carbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducción de señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente de carbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, se realizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevos reguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuente de carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías que regulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology para determinar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a las categorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo de fosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron también genes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por los promotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió como reguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cada subunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos de inositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de las subunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos de fosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a su vez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad de una regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estos procesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además en relación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulación inhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de la expresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega un rol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino de señalización cAMP-PKA.Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internal physiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditions can result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium, and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face of variable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensing systems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptly variations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity, acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. When environmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomic expression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA) controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer with two catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer of regulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuli activating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium; while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratory metabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificity of the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMP concentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence or absence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and its substrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little is known about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of this work was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of the genes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including different carbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolic pathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. As a first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels we determined that the expression level of PKA subunit promoters is different during the growth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 the lowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA, or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatory behavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmotic stress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simple deletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1 kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed its presence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in the presence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a marked increment in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbon source signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as a repressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1 promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate the presence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and its downstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having an important role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunits promoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, and that the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated in the regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, we carried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Array technique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. This study was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysis let us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the four promoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging to transcription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolism affected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in different regulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolism which affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belonging to categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of the results pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novel upstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from this work we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associated with the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocal regulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and these processes would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is in concordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitory regulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKA subunits plays an important role in determining the specificity of the response in the cAMP-PKA signaling transduction pathway.Fil:Pautasso, María Constanza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Transcriptional regulation of the protein kinase A subunits in Saccharomyces cerevisiae: autoregulatory role of the kinase A activity

Protein kinase A (PKA) is a broad specificity protein kinase that controls a physiological response following the increment of cAMP as a consequence of a particular stimulus. The specificity of cAMP-signal transduction is maintained by several levels of control acting all together. Herein we present the study of the regulation of the expression of each PKA subunit, analyzing the activity of their promoters. The promoter of each isoform of TPK and of BCY1 is differentially activated during the growth phase. A negative mechanism of isoform-dependent autoregulation directs TPKs and BCY1 gene expressions. TPK1 promoter activity is positively regulated during heat shock and saline stress. The kinase Rim15, but not the kinase Yak1, positively regulates TPK1 promoter. Msn2/4, Gis1, and Sok2 are transcription factors involved in the regulation of TPK1 expression during stress. TPK2, TPK3, and BCY1 promoters, unlike TPK1, are not activated under stress conditions, although all the promoters are activated under low or null protein kinase A activity. These results indicate that subunits share an inhibitory autoregulatory mechanism but have different mechanisms involved in response to heat shock or saline stress.Fil: Pautasso, María Constanza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Rossi, Silvia Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Transcriptional regulation of the protein kinase a subunits in Saccharomyces cerevisiae during fermentative growth

Yeast cells can adapt their growth in response to the nutritional environment. Glucose is the favourite carbon source of Saccharomyces cerevisiae, which prefers a fermentative metabolism despite the presence of oxygen. When glucose is consumed, the cell switches to the aerobic metabolism of ethanol, during the so-called diauxic shift. The difference between fermentative and aerobic growth is in part mediated by a regulatory mechanism called glucose repression. During glucose derepression a profound gene transcriptional reprogramming occurs and genes involved in the utilization of alternative carbon sources are expressed. Protein kinase A (PKA) controls different physiological responses following the increment of cAMP as a consequence of a particular stimulus. cAMP–PKA is one of the major pathways involved in the transduction of glucose signalling. In this work the regulation of the promoters of the PKA subunits during respiratory and fermentative metabolism are studied. It is demonstrated that all these promoters are upregulated in the presence of glycerol as carbon source through the Snf1/Cat8 pathway. However, in the presence of glucose as carbon source, the regulation of each PKA promoter subunits is different and only TPK1 is repressed by the complex Hxk2/Mig1 in the presence of active Snf1.Fil: Galello, Fiorella Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Pautasso, María Constanza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Reca, Sol Rita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Cañonero, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Portela, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Moreno, Silvia Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Rossi, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

Identification of novel transcriptional regulators of PKA subunits in Saccharomyces cerevisiae by quantitative promoter-reporter screening

The cAMP-dependent protein kinase (PKA) signaling is a broad pathway that plays important roles in the transduction of environmental signals triggering precise physiological responses. However, how PKA achieves the cAMP-signal transduction specificity is still in study. The regulation of expression of subunits of PKA should contribute to the signal specificity. Saccharomyces cerevisiae PKA holoenzyme contains two catalytic subunits encoded by TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and two regulatory subunits encoded by BCY1 gene. We studied the activity of these gene promoters using a fluorescent reporter synthetic genetic array screen, with the goal of systematically identifying novel regulators of expression of PKA subunits. Gene ontology analysis of the identified modulators showed enrichment not only in the category of transcriptional regulators, but also in less expected categories such as lipid and phosphate metabolism. Inositol, choline and phosphate were identified as novel upstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. The results support the role of transcription regulation of PKA subunits in cAMP specificity signaling. Interestingly, known targets of PKA phosphorylation are associated with the identified pathways opening the possibility of a reciprocal regulation. PKA would be coordinating different metabolic pathways and these processes would in turn regulate expression of the kinase subunits.Fil: Pautasso, María Constanza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Reca, Sol Rita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Chatfield Reed, Kate. University of Calgary; CanadáFil: Chua, Gordon. University of Calgary; CanadáFil: Galello, Fiorella Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Portela, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Zaremberg, Vanina. University of Calgary; CanadáFil: Rossi, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

Heat stress regulates the expression of TPK1 gene at transcriptional and post-transcriptional levels in Saccharomyces cerevisiae

In Saccharomyces cerevisiae cAMP regulates different cellular processes through PKA. The specificity of the response of the cAMP-PKA pathway is highly regulated. Here we address the mechanism through which the cAMP-PKA pathway mediates its response to heat shock and thermal adaptation in yeast. PKA holoenzyme is composed of a regulatory subunit dimer (Bcy1) and two catalytic subunits (Tpk1, Tpk2, or Tpk3). PKA subunits are differentially expressed under certain growth conditions. Here we demonstrate the increased abundance and half-life of TPK1 mRNA and the assembly of this mRNA in cytoplasmic foci during heat shock at 37 °C. The resistance of the foci to cycloheximide-induced disassembly along with the polysome profiling analysis suggest that TPK1 mRNA is impaired for entry into translation. TPK1 expression was also evaluated during a recurrent heat shock and thermal adaptation. Tpk1 protein level is significantly increased during the recovery periods. The crosstalk of cAMP-PKA pathway and CWI signalling was also studied. Wsc3 sensor and some components of the CWI pathway are necessary for the TPK1 expression upon heat shock. The assembly in foci upon thermal stress depends on Wsc3. Tpk1 expression is lower in a wsc3∆ mutant than in WT strain during thermal adaptation and thus the PKA levels are also lower. An increase in Tpk1 abundance in the PKA holoenzyme in response to heat shock is presented, suggesting that a recurrent stress enhanced the fitness for the coming favourable conditions. Therefore, the regulation of TPK1 expression by thermal stress contributes to the specificity of cAMP-PKA signalling.Fil: Cañonero, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Pautasso, María Constanza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Galello, Fiorella Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Pietrasanta, Lia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Arroyo, Javier. Universidad Complutense de Madrid; EspañaFil: Bermudez Moretti, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Portela, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Rossi, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentin

Chromatin remodeling and transcription of the TPK1 subunit of PKA during stress in Saccharomyces cerevisiae

In response to environmental changes cells rapidly rearrange their gene expression pattern in order to adapt to the new conditions. Chromatin remodeling is critical for this process playing a major role in the induction of genes involved in stress responses. We demonstrated previously that TPK1, encoding one of the catalytic subunits of PKA from Saccharomyces cerevisiae, is upregulated under heat shock. Herein, we investigate the chromatin remodeling of the TPK1, TPK2 and TPK3 promoters under heat stress. The TPK1 promoter is the only one that presents three positioned nucleosomes. Upon heat stress or osmostress these nucleosomes are evicted in clear correlation with promoter activation and upregulation of TPK1 mRNA levels. We find that remodelers SWI/SNF, RSC, INO80 and ISW1 participate in chromatin remodeling of the TPK1 promoter under thermal stress conditions. RSC and INO80 are necessary for nucleosomes positioning and contribute to repression of the TPK1 promoter under normal conditions while SWI/SNF participates in the eviction of nucleosomes after heat stress. SWI/SNF complex is recruited to the TPK1 promoter upon heat shock in a Msn2/4-dependent manner. Finally, both Tpk1 and Tpk2 catalytic subunits are recruited to the TPK1 promoter with opposite association patterns. Tpk1 catalytic activity is necessary for nucleosome rearrangement on the TPK1 promoter while Tpk2 and Tpk3 inhibit the promoter activity and maintain a repressive chromatin conformation. This work enlightens the mechanism of regulation of TPK1 expression during heat-stress, contributing to the knowledge of specificity in fine-tuning the cAMP-PKA signaling circuit.Fil: Reca, Sol Rita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Galello, Fiorella Ariadna. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Ojeda, Lucas Ezequiel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Pautasso, María Constanza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Cañonero, Luciana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Moreno, Silvia Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Portela, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Rossi, Silvia Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin