СИНТЕЗ И ПАРАМЕТРЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С АНТИТЕЛАМИ НОВОГО БИОКОНЪЮГАТА ХЛОРАМФЕНИКОЛ-ДИЭТИЛЕНТРИАМИНТЕТРААЦЕТАТ ЕВРОПИЯ

A conjugate has been obtained in the reaction of chloramphenicol 3-hemisuccinate with diethylenetriaminepentaacetic acid N1 -(2-aminoethylamide) Eu3+-complexonate. Kinetic and equilibrium parameters of conjugate binding to polyclonal antichloramphenicol antibodies biospecifically immobilized onto microtiter plate wells were determined. It was concluded that the new bioconjugate can be used in a lanthanide immunofluorometric assay of chloramphenicol.В реакции N-сукцинимидного эфира 3-гемисукцината хлорамфеникола с Eu3+ -комплексонатом N1 -(2-аминоэтил- амида) диэтилентриаминпентауксусной кислоты и получен конъюгат антибиотика с лантанидохелатом. Определены кинетическая зависимость и равновесные параметры связывания конъюгата с поликлональными антителами к хлорамфениколу, биоспецифически иммобилизованными в лунках микропланшета. Сделан вывод о возможности использования конъюгата для лантанидного иммунофлуориметрического анализа хлорамфеникола

Некоторые металлсвязывающие свойства рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных коз

In this research, the ability of pure recombinant human lactoferrin (rhLF), originated from the milk of transgenic goats, to bind ferric and europium ions has been shown by the methods of spectrophotometry, fluorescent spectroscopy, and inductively coupled plasma mass spectrometry. The apo-form of rhLF and its complexes with Fe3+ or Eu3+ saturated in 76 or 22 %, respectively, were obtained. A method for detection of total or released (“free”) lanthanide at acidic or neutral pH and high or low concentrations of chelating agents by time-resolved fluorescence was proposed.Методами спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии и масс-спектрометрии показано, что человеческий рекомбинантный лактоферрин (рчЛФ), выделенный из молока трансгенных коз, способен связывать ионы железа и европия. Получены апо-форма рчЛФ, а также комплексы этого белка с Fe3+ и Eu3+, в которых степень насыщения рчЛФ металлом соответственно составила 76 и 22 %. Предложен способ регистрации общего или высвободившегося лантанида в системе, содержащей комплекс рчЛФ–Eu3+, при кислом или нейтральном значении рН и высоких или низких концентрациях хелатирующих агентов по интенсивности времяразрешенной флуоресценции

НОВЫЙ ПОДХОД К ИММУНОХИМИЧЕСКОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ БРАССИНОСТЕРОИДОВ

For the first time, reagents have been synthesized and a technique has been developed for a lanthanide immunofluorometric assay of phytohormonal steroids of 24-epicastasterone and 24-epibrassinolide. A low-molecular-weight conjugate of the brassinosteroid and an Eu3+ complexonate was synthesized by the reaction of 24-epicastasterone-6-(O-carboxymethyl) oxime N-succinimide ester with the europium salt of the diethylenetriaminepentaacetic acid N1-(aminoethyl)amide. A protein conjugate with a high specific fluorescent activity was the product of a simultaneous acylation of primary amino groups in albumin with activated esters of carboxyl derivatives of 24-epicastasterone and an Eu3+ complexonate. Using the high-molecular weight conjugate in an immunochemical system, a linear relationship was obtained between a fluorescent signal of labeled 24-epiсastasterone bound to immobilized antibodies and 24-epibrassinolide concentration in the range of 1 to 300 nM.Впервые получены реагенты и разработана методика лантанидного иммунофлуориметрического анализа фитогормональных стероидов 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида. В реакции N-сукцинимидного эфира 6-(О-карбоксиметил)оксима 24-эпикастастерона с европиевой солью N1-(аминоэтил)амида диэтилентриаминпентауксусной кислоты синтезирован низкомолекулярный конъюгат брассиностероид-комплексонат Eu3+. Продуктом одновременного ацилирования первичных аминогрупп полипептидной цепи альбумина активированными эфирами карбоксипроизводных 24-эпикастастерона и комплексоната Eu3+ является белковый конъюгат, обладающий высокой удельной флуоресцентной активностью. При использовании высокомолекулярного конъюгата в иммунохимической системе получена линейная зависимость флуоресцентного сигнала меченого 24-эпикастастерона, связанного с иммобилизованными антителами, от концентрации 24-эпибрассинолида (1–300 нМ) в растворе

РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИНА Т-2 В КОРМАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

A reagent kit EIA-TOXIN T-2 for the determination of mycotoxin T-2 toxin in feeds and foods by a direct competitive enzyme immunoassay using microtitration plate has been developed and tested. The evaluated parameters of the kit and metrological characteristics of the technique of measurements correspond to the modern level of immunoassay development and provide the determination of T-2 toxin content of agricultural products in a range of 30 to 1000 mg/kg with proper accuracy and precision.Разработан и испытан набор реагентов ИФА-ТОКСИН Т-2 для определения токсина Т-2 в кормах и пищевой продукции методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа в микропланшетном формате. Установленные технико-аналитические параметры набора и метрологические характеристики методики выполнения измерений соответствуют современному уровню развития иммуноанализа и позволяют с надлежащей точностью определять содержание токсина Т-2 в диапазоне от 30 до 1000 мкг/кг в сельскохозяйственной продукции. 

Иммуноферментные системы и набор реагентов для определения бацитрацина в пищевых продуктах

Two test-systems for a direct and an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of peptide antibiotic bacitracin (BC) were developed and studied. For the both systems, polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits with a conjugate of BC with keyhole limpet hemocyanine synthesized using reaction between the peptide and the high molecular weight protein in the presence of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). The product of BC linking to thyroglobulin which was activated with EDC and N-hydroxysulfosuccinimide served as conjugated antigen on a solid phase in the indirect ELISA. For the direct ELISA, the antibodies against BC were immunochemically immobilized onto microplate surface, while the liquid phase contained a conjugate of BC with horseradish peroxidase. This conjugate was obtained by successive reactions of antibiotic amino groups coupling to periodate oxidized carbohydrate chains of enzyme and the reducting of formed Shiff’s base with sodium borohydride. Conjugated antigens binding to anti-BC antibodies provided maximum colorimetric signals of 2.0 and 1.2 optical units for the direct and indirect ELISA, respectively, and depended on BC content in the liquid phase. Antibiotic concentration that caused the inhibition of binding by 50 % was 2.6 ng/ml in the direct ELISA and 10.0 ng/ml in the indirect ELISA. The simple and sensitive direct ELISA system was used as a prototype of the finished reagent kit and a method for measurements with technical-analytical parameters and metrological characteristics allowing the determination of BC residues in a variety of foods including 14 items in a concentration range of 9.0 to 405.0 pg/kg with proper accuracy and precision.Разработаны тест-системы для непрямого и прямого иммуноферментного анализа (ИФА) пептидного антибиотика бацитрацина (Бц). Поликлональные антитела для обеих тест-систем получены иммунизацией кроликов конъюгатом Бц и гемоцианина улитки, который синтезировали взаимодействием пептида с белком в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC). В системе непрямого ИФА твердофазным конъюгированным антигеном служил продукт присоединения Бц к тироглобулину, предварительно активированному EDC и N-гидроксисульфосукцинимидом. Для прямого ИФА на поверхности лунок микропланшета были иммунохимически иммобилизованы антитела к Бц, а жидкая фаза содержала конъюгат Бц с пероксидазой из корней хрена, полученный путем последовательных реакций присоединения аминогрупп Бц к окисленной периодатом углеводной части фермента и восстановления образовавшегося основания Шиффа борогидридом натрия. В системах прямого ИФА и непрямого ИФА связывание конъюгированных антигенов с антителами к Бц обусловливало максимальные колориметрические сигналы около 2,0 и 1,2 единиц оптической плотности соответственно и зависело от содержания Бц в жидкой фазе. При этом концентрации антибиотика, вызывающие ингибирование связывания на 50 %, составили 2,6 нг/мл в прямом ИФА и 10,0 нг/мл в непрямом ИФА. Простая и чувствительная система прямого ИФА послужила прототипом для создания готового набора реагентов и методики выполнения измерений, технико-аналитические параметры и метрологические характеристики которых позволяют определять остаточные количества Бц в пищевой продукции животного происхождения расширенного перечня, включающего 14 наименований, в диапазоне от 9,0 до 405,0 мкг/кг с надлежащей правильностью и точностью

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА

A reagent kit EIA-DEOXYNIVALENOL for the determination of mycotoxin deoxynivalenol (DON) in feeds and foods by a direct competitive enzyme immunoassay using microtitration plate has been developed and tested. The basic components of the kit are polyclonal antibodies to DON, obtained as a result of immunization of rabbits with a conjugate of DON with bovine serum albumin and a conjugate of horseradish peroxidase with DON. The evaluated parameters of the kit and metrological characteristics of the technique of measurements correspond to the modern level of immunoassay development and provide the determination of DON content of agricultural products in a range of 0.2 to 6.0 mg/kg with proper accuracy and precision. The limit of quantitative determination of DON in grain and cereal foods does not exceed 0.2 mg/kg.Разработан и испытан набор реагентов «ИФА-ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ» для определения дезоксиниваленола (ДОН) в кормах для животных, пищевой продукции и продовольственном сырье методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа в микропланшетном формате. Базовые компоненты набора представляют собой поликлональные антитела к ДОН, полученные в результате иммунизации кроликов конъюгатом ДОН с бычьим сывороточным альбумином, и конъюгат пероксидазы из корней хрена с микотоксином. Установлены технико-аналитические параметры набора и метрологические характеристики методики выполнения измерений. Набор позволяет с надлежащей точностью определять ДОН в диапазоне концентраций от 0,2 до 6,0 мг/кг, предел количественного определения исследуемого микотоксина в зерне и продуктах его переработки не превышает 0,2 мг/кг

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ФУМОНИЗИНОВ ГРУППЫ В В КОРМАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

A reagent kit EIA-FUMONISIN for the determination of mycotoxins of fumonisin B group in feeds and foods by a direct competitive enzyme immunoassay using microtitration plate has been developed and tested. The evaluated technicoanalytical parameters of the kit and metrological characteristics of the technique of measurements correspond to the mo- dern level of immunoassay development and provide the determination of fumonisin group B content of agricultural products in a range of 0.11 to 6.0 mg/kg with proper accuracy and precision.Разработан и прошел внутрилабораторные испытания набор реагентов ИФА-ФУМОНИЗИН для определения микотоксинов, относящихся к фумонизинам группы В, в кормах и пищевой продукции методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В состав набора входят разборный микропланшет, в лунках которого биоспецифически иммобилизовано моноклональное антитело, готовый к использованию раствор конъюгата фумонизина В1 с пероксидазой из корней хрена, градуировочные растворы, раствор хромогена (ТМБ), субстратный раствор (или готовый к использованию хромоген-субстратный раствор) и стоп-реагент. Установленные технико-аналитические параметры набора и метрологические характеристики методики выполнения измерений соответствуют современному уровню развития ИФА и позволяют с надлежащей точностью определять содержание фумонизинов в диапазоне от 0,11 до 6,0 мг/кг в сельскохозяйственной продукции

Метод прямого конкурентного иммуноферментного анализа для определения охратоксина а в кормах и пищевых продуктах

A reagent kit EIA-OCHRATOXIN A for the determination of mycotoxin ochratoxin A in feeds and foods by a  direct  competitive  enzyme  immunoassay  using  microtitration  plate  has  been  developed  and  tested.  The  conjugate of ochratoxin A with horseradish peroxidase was synthesized using the mycotoxin aminoderivative joined to the carbohydrate chain of the enzyme. A monoclonal antibody to the mycotoxin was immobilized on the surface of plate wells through sheep anti-mouse antibodies. The evaluated parameters of the kit and metrological characteristics of the technique of measurements correspond to the modern level of immunoassay development and provide the determination of ochratoxin A content of agricultural products in a range of 5 to 375 mg/kg with proper accuracy and precision. The limit of quantitative determination of ochratoxin A in grain and cereal foods does not exceed 5 mg/kg.Разработан и испытан набор реагентов «ИФА-ОХРАТОКСИН А» для определения охратоксина А в кормах и пищевой продукции методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа в микропланшетном формате. Конъюгат охратоксина А с пероксидазой из корней хрена получен с использованием аминопроизводного микотоксина, присоединенного к углеводной цепи фермента. Моноклональное антитело к определяемому микотоксину иммобилизовано в лунках планшета через антивидовые антитела барана к иммуноглобулинам мыши. Установлены технико-аналитические параметры набора «ИФА-ОХРАТОКСИН А» и метрологические характеристики методики выполнения измерений. Набор позволяет с надлежащей точностью определять охратоксин А в диапазоне содержания от 5 до 375 мкг/кг, предел количественного определения микотоксина в зерне и в продуктах его переработки составляет 5 мкг/кг

Тривимірна густинна модель земної кори центральної частини Голованівської шовної зони Українського щита

Three-dimensional Earth’s crust density model of the central part of the Golovanevsk suture zone of the Ukrainian Shield at the scale 1:50 000 has been given. Model calculations were carried out using automated complex GMT-Auto. The model takes into account the change in density both laterally in accordance with petrophysical data; and with depth in accordance with seismometry data. In this case; an abrupt change in the density in one direction or another; of the inversion zone and zone of constant density was taken into consideration. The density of rated bodies on the surface of the basement was defined based on the percentage ratio of the constituent rocks; in the depth — from the dependence of density on velocity. The block structure of the Earth’s crust upper part; which was previously revealed by seismometry in some areas of the zone; was confirmed. During the modeling it was found out that the structure of investigated territory in the density model from the surface to a depth of ³ 20 km is divided into the central; eastern and western parts. The central one; which corresponds to the most part of the Golovanevsk suture zone; is represented by rocks; whose density is much higher than in the western and especially in the eastern parts. The existence of essentially decompacted rocks in the eastern and northern parts of the zone to a depth of 10 km indicates the presence of granitization processes in the past. From the depth of 30 km and up to the Moho discontinuity two parts are distinguished: the western and the eastern. These parts are separated by a sharp submeridional stage in the Moho discontinuity from 46 to 55—65 km; which are traced along the center line of the Golovanevsk suture zone. The density of rocks is much higher in the western part both in area and with depth. The density distribution across the entire crustal section was obtained both in local structures with an abnormally high density on the surface of the basement (represented by gabbro amphibolites; ferruginous quartzites; crystal shales and gneiss garnet-biotite gneisses) and in the enclosing rocks. The performed calculations made it possible in the first approximation to determine the nature of the density variation with depth in the anomalous structures and to establish the depth of their propagation. According to preliminary data; these structures can be traced to a depth of 3—5 km.Дана трехмерная модель плотности земной коры центральной части Голованевской шовной зоны Украинского щита в масштабе 1:50 000. Модельные расчеты проводились с использованием автоматизированного комплекса GMT-Auto. Модель учитывает изменение плотности как в поперечном направлении в соответствии с петрофизическими данными; и с глубиной в соответствии с данными сейсмометрии. В этом случае; резкое изменение плотности в том или ином направлении; зоны инверсии и зоны постоянной плотности. Плотность расчетных тел на поверхности фундамента определялась на основе процентного соотношения составляющих пород; в глубине - от зависимости плотности от скорости. Структурная структура верхней части земной коры; который ранее был обнаружен сейсмометрией в некоторых районах зоны; был подтвержден. Во время моделирования выяснилось, что структура исследуемой территории в модели плотности от поверхности до глубины ³ 20 км делится на центральную; восточной и западной частей. Центральный; что соответствует большей части Голованевской шовной зоны; представлен камнями; плотность которых намного выше, чем в западной и особенно в восточной частях. Существование существенно декомпактированных пород в восточной и северной частях зоны до глубины 10 км указывает на наличие процессов гранитизации в прошлом. С глубины 30 км и до разрыва Мохо выделяются две части: западная и восточная. Эти части разделены острой субмеридиональной стадией в разрыве Мохо от 46 до 55-65 км; которые прослеживаются вдоль центральной линии Голованевской шовной зоны. Плотность горных пород значительно выше в западной части как по площади, так и по глубине. Распределение плотности по всему участку земной коры было получено как в локальных структурах с аномально высокой плотностью на поверхности фундамента (представлен габбро-амфиболитами, железистыми кварцитами, хрустальными сланцами и гнейсовыми гранат-биотитовыми гнейсами) и в вмещающих породах. Выполненные расчеты позволили в первом приближении определить характер изменения плотности с глубиной в аномальных структурах и установить глубину их распространения. По предварительным данным; эти структуры можно проследить до глубины 3-5 км.Дана тривимірна модель щільності земної кори центральної частини Голованівської шовної зони Українського щита в масштабі 1:50 000. Модельні розрахунки проводилися з використанням автоматизованого комплексу GMT-Auto. Модель враховує зміну щільності як в поперечному напрямку відповідно до петрофізіческімі даними; і з глибиною відповідно до даних сейсмометрії. В цьому випадку; різка зміна щільності в тому чи іншому напрямку; зони інверсії і зони постійної щільності. Щільність розрахункових тел на поверхні фундаменту визначалася на основі процентного співвідношення складових порід; в глибині - від залежності щільності від швидкості. Структурна структура верхньої частини земної кори; який раніше був виявлений сейсмометрів в деяких районах зони; був підтверджений. Під час моделювання з'ясувалося, що структура досліджуваної території в моделі щільності від поверхні до глибини ³ 20 км ділиться на центральну; східній і західної частин. центральний; що відповідає більшій частині Голованівської шовної зони; представлений камінням; щільність яких набагато вище, ніж в західній і особливо в східній частинах. Існування істотно декомпактірованних порід в східній і північній частинах зони до глибини 10 км вказує на наявність процесів гранитизации в минулому. З глибини 30 км і до розриву Мохо виділяються дві частини: західна і східна. Ці частини розділені гострої субмеридіональна стадією в розриві Мохо від 46 до 55-65 км; які простежуються вздовж центральної лінії Голованівської шовної зони. Щільність гірських порід значно вище в західній частині як по площі, так і по глибині. Розподіл щільності по всій ділянці земної кори було отримано як в локальних структурах з аномально високою щільністю на поверхні фундаменту (представлений габро-амфіболіти, залізистих кварцитів, кришталевими сланцями і гнейсовой гранат-біотитових гнейсами) і в породах, що вміщають. Виконані розрахунки дозволили в першому наближенні визначити характер зміни щільності з глибиною в аномальних структурах і встановити глибину їх поширення. За попередніми даними; ці структури можна простежити до глибини 3-5 км