Estudo das interações do gene PSO2 de Saccharomyces cerevisiae com genes da resposta a danos no DNA após tratamento com agentes indutores de pontes intercadeia

O DNA sofre constantes ataques de agentes que podem causar danos estruturais em uma ou em ambas as cadeias. Os agentes mutagênicos bifuncionais, amplamente utilizados como quimioterápicos, produzem uma lesão do tipo ponte intercadeia (ICL), que consiste numa ligação covalente entre as duas cadeias do DNA. As ICLs causam o bloqueio da replicação e da transcrição do DNA, e sua resolução pode levar à formação de quebras-duplas (DSBs). A célula utiliza vários mecanismos para reparar ICLs, entre os quais está a proteína Pso2, cuja transcrição é ativada especificamente após a indução desta lesão na célula. Visando à melhor caracterização da função da Pso2p na reparação de ICLs, buscou-se neste trabalho a identificação de proteínas interativas com Pso2p, através do sistema dois-híbridos em levedura. Entre as proteínas de fusão isoladas, a cinase Sak1 despertou grande interesse. Verificou-se que Sak1p interage com o domínio C-terminal β-CASP de Pso2p, além de fosforilar Pso2p in vitro. Ainda, Pso2p e Sak1p apresentaram interação epistática após tratamento com agentes indutores de ICLs. A partir desses resultados, investigou-se a interação dos genes que codificam para estas proteínas com outros genes da resposta a danos no DNA. Verificou-se que YKU70 não interage geneticamente com PSO2 após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado (8-MOP+UVA) e mostarda nitrogenada (HN2). As interações observadas após tratamento com 8-MOP+UVA para os genes do complexo MRX indicam que Mre11p (produto do gene MRE11) compete pelo mesmo substrato com as proteínas Pso2 e Sak1, mas atuam em vias diferentes de reparação de ICLs. Para o gene RAD50, constatou-se interação epistática com PSO2 e SAK1, apontando para a participação das proteínas Rad50, Pso2 e Sak1 na mesma via de reparação de ICLs. O gene XRS2, por sua vez, interagiu de forma não epistática com SAK1, indicando que as respectivas proteínas atuam em vias e substratos diferentes durante a reparação de ICLs. Por outro lado, constatou-se que não há interação genética de TEL1 e TOR1 com o gene PSO2 após tratamento com 8-MOP+UVA, sugerindo que as cinases Tel1 e Tor1 não participam da sinalização para a reparação de ICLs na via que inclui Pso2p. Com estes resultados, nós mostramos que a cinase Sak1 é importante para a atuação da nuclease Pso2 na reparação de quebras duplas no DNA. Conforme o modelo proposto neste trabalho, esta interação possivelmente seja necessária para ativar a função endonucleásica da proteína Pso2, recentemente identificada, para permitir a abertura de estruturas do tipo hairpin (grampo), que se formam no DNA em consequência de ICLs.DNA is often threatened by agents that may cause structural damage on one or both strands. Bifunctional mutagenic agents that are largely used as chemotherapeutics, produce a serious damage, namely interstrand crosslink (ICL), that covalently link both DNA strands. The formation of ICLs blocks DNA replication and transcription, and their processing may cause double strand-breaks (DSBs). Cells utilize many mechanisms to repair ICLs, including the Pso2 protein, which transcription is induced specifically after the formation of this lesion in DNA. In this study, we aimed to extend the characterization of Pso2 function in ICL repair trough the identification of interacting proteins, using the two-hybrid system (THS) in yeast. In addition, the genetic interaction of PSO2 with genes involved in early stages of ICL repair was also investigated. Among the fusion proteins isolated by THS, Sak1 kinase has raised great interest for further investigation. The results showed that Sak1p interacts with the C-terminal β-CASP domain of Pso2p and is able to phosphorylate Pso2p in vitro. Pso2p and Sak1p showed epistatic interaction after treatment with ICL-inducing agents. Based on these results, we investigated the interaction of PSO2 and SAK1 genes with other genes involved in DNA DSB repair. We found that YKU70 does not interact with PSO2 after treatments with photoactivated (8-methoxypsoralen) 8-MOP+UVA and nitrogen mustard (HN2). The interactions observed for MRX genes after treatment with 8-MOP+UVA indicate that Mre11p (product of MRE11 gene) competes with Pso2p and Sak1p for the same substrate, but act in different ICL repair pathways. XRS2 gene, in turn, showed an additive interaction with SAK1 indicating that the respective proteins act in different substrates and pathways during ICL repair. On the other hand, RAD50 presents epistatic interaction with PSO2 and SAK1 genes, pointing to the participation of Rad50, Pso2 and Sak1 proteins in the same pathway for ICL repair, in exponentially growing S. cerevisiae cells. Regarding to the TEL1 and TOR1 genes, it was found no genetic interaction with PSO2 gene after exposure to 8-MOP+UVA, suggesting that Tel1 and Tor1 kinases do not participate in signaling for ICL repair in the pathway which Pso2 nuclease acts. Considering these results, we showed that Sak1 kinase plays an important role in contribution to Pso2 nuclease in the repair of ICL-induced DSBs. According to the proposed model in this work, this interaction is possibly necessary to activate Pso2 endonucleolytic activity, recently identified to the opening of hairpin structures, which are formed as a result of the DNA ICLs

Estudo das interações do gene PSO2 de Saccharomyces cerevisiae com genes da resposta a danos no DNA após tratamento com agentes indutores de pontes intercadeia

O DNA sofre constantes ataques de agentes que podem causar danos estruturais em uma ou em ambas as cadeias. Os agentes mutagênicos bifuncionais, amplamente utilizados como quimioterápicos, produzem uma lesão do tipo ponte intercadeia (ICL), que consiste numa ligação covalente entre as duas cadeias do DNA. As ICLs causam o bloqueio da replicação e da transcrição do DNA, e sua resolução pode levar à formação de quebras-duplas (DSBs). A célula utiliza vários mecanismos para reparar ICLs, entre os quais está a proteína Pso2, cuja transcrição é ativada especificamente após a indução desta lesão na célula. Visando à melhor caracterização da função da Pso2p na reparação de ICLs, buscou-se neste trabalho a identificação de proteínas interativas com Pso2p, através do sistema dois-híbridos em levedura. Entre as proteínas de fusão isoladas, a cinase Sak1 despertou grande interesse. Verificou-se que Sak1p interage com o domínio C-terminal β-CASP de Pso2p, além de fosforilar Pso2p in vitro. Ainda, Pso2p e Sak1p apresentaram interação epistática após tratamento com agentes indutores de ICLs. A partir desses resultados, investigou-se a interação dos genes que codificam para estas proteínas com outros genes da resposta a danos no DNA. Verificou-se que YKU70 não interage geneticamente com PSO2 após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado (8-MOP+UVA) e mostarda nitrogenada (HN2). As interações observadas após tratamento com 8-MOP+UVA para os genes do complexo MRX indicam que Mre11p (produto do gene MRE11) compete pelo mesmo substrato com as proteínas Pso2 e Sak1, mas atuam em vias diferentes de reparação de ICLs. Para o gene RAD50, constatou-se interação epistática com PSO2 e SAK1, apontando para a participação das proteínas Rad50, Pso2 e Sak1 na mesma via de reparação de ICLs. O gene XRS2, por sua vez, interagiu de forma não epistática com SAK1, indicando que as respectivas proteínas atuam em vias e substratos diferentes durante a reparação de ICLs. Por outro lado, constatou-se que não há interação genética de TEL1 e TOR1 com o gene PSO2 após tratamento com 8-MOP+UVA, sugerindo que as cinases Tel1 e Tor1 não participam da sinalização para a reparação de ICLs na via que inclui Pso2p. Com estes resultados, nós mostramos que a cinase Sak1 é importante para a atuação da nuclease Pso2 na reparação de quebras duplas no DNA. Conforme o modelo proposto neste trabalho, esta interação possivelmente seja necessária para ativar a função endonucleásica da proteína Pso2, recentemente identificada, para permitir a abertura de estruturas do tipo hairpin (grampo), que se formam no DNA em consequência de ICLs.DNA is often threatened by agents that may cause structural damage on one or both strands. Bifunctional mutagenic agents that are largely used as chemotherapeutics, produce a serious damage, namely interstrand crosslink (ICL), that covalently link both DNA strands. The formation of ICLs blocks DNA replication and transcription, and their processing may cause double strand-breaks (DSBs). Cells utilize many mechanisms to repair ICLs, including the Pso2 protein, which transcription is induced specifically after the formation of this lesion in DNA. In this study, we aimed to extend the characterization of Pso2 function in ICL repair trough the identification of interacting proteins, using the two-hybrid system (THS) in yeast. In addition, the genetic interaction of PSO2 with genes involved in early stages of ICL repair was also investigated. Among the fusion proteins isolated by THS, Sak1 kinase has raised great interest for further investigation. The results showed that Sak1p interacts with the C-terminal β-CASP domain of Pso2p and is able to phosphorylate Pso2p in vitro. Pso2p and Sak1p showed epistatic interaction after treatment with ICL-inducing agents. Based on these results, we investigated the interaction of PSO2 and SAK1 genes with other genes involved in DNA DSB repair. We found that YKU70 does not interact with PSO2 after treatments with photoactivated (8-methoxypsoralen) 8-MOP+UVA and nitrogen mustard (HN2). The interactions observed for MRX genes after treatment with 8-MOP+UVA indicate that Mre11p (product of MRE11 gene) competes with Pso2p and Sak1p for the same substrate, but act in different ICL repair pathways. XRS2 gene, in turn, showed an additive interaction with SAK1 indicating that the respective proteins act in different substrates and pathways during ICL repair. On the other hand, RAD50 presents epistatic interaction with PSO2 and SAK1 genes, pointing to the participation of Rad50, Pso2 and Sak1 proteins in the same pathway for ICL repair, in exponentially growing S. cerevisiae cells. 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Clonagem, expressão e purificação de EIF2 beta humano e produção de soro policlonal anti-EIF2 beta

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