Studio dei meccanismi di regolazione dell’espressione di una nuova classe di glutatione transferasi: GST-Omega

RIASSUNTO Le glutatione transferasi (GST) sono una superfamiglia di enzimi detossificanti di fase II che, utilizzando il glutatione come cofattore, contribuiscono alla biotrasformazione di numerosi composti di natura esogena ed endogena, come agenti cancerogeni, farmaci e prodotti dello stress ossidativo (Townsend D.M. et Tew K.D., 2003). La superfamiglia delle GST si suddivide in tre famiglie: citosoliche, mitocondriali e MAPEG (Membrane-Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism) (Ladner J.E. & al., 1999; Robinson A. & al., 2004). La superfamiglia delle GST citosoliche ¨¨ la pi¨´ ampia ed ¨¨ costituita da proteine estremamente polimorfe. Nell¡¯uomo sono state identificate varie classi denominate: ¦Á, ¦Ì, ¦Ð, ¦È, ¦Æ,, ¦Ò; recentemente ¨¨ stata aggiunta una nuova classe denominata omega (GSTO) (Board P.G. & al.,2000). L¡¯enzima deidroascorbato reduttasi, purificato per la prima volta nel 1994 dal fegato di ratto nel laboratorio in cui ho svolto la presente tesi (Maellaro E. & al.1994), ¨¨ il capostipite di questa nuova classe di glutatione transferasi. Nel 1998, il cDNA di tale enzima ¨¨ stato clonato (Ishikawa T. & al., 1998). Nel 1999 un gruppo americano ha clonato il cDNA di una nuova proteina murina (p28) che veniva sovraespressa in una linea di linfoma radioresistente (Kodym R. & al., 1999). Gli stessi autori hanno inoltre inserito in banca dati la sequenza dell¡¯omologa proteina umana. Successivamente nel 2000 Board et al. hanno raggruppato queste tre proteine in un¡¯unica classe di GST, cui hanno dato il nome di classe Omega (Board P.G. & al.,2000). Le proteine appartenenti alle GSTO mostrano caratteristiche assai peculiari: sono prive di attivit¨¤ glutatione transferasica, ma sono dotate di numerose altre funzioni di grande importanza nella risposta allo stress cellulare quali l¡¯attivit¨¤ tioltransferasica e deidroascorbato reduttasica, la modulazione del trasporto del calcio, l¡¯attivazione post-traduzionale di altre proteine, la risposta allo shock di natura termica e chimica e l¡¯intervento nel metabolismo dell¡¯arsenico (Board P.G. & al.,2000; Dulhunty A. & al., 2000; Laliberte R.E. & al., 2003; Kodym R. & al., 1998; Zakharyan R.A. & al., 2001). Nell¡¯uomo esistono due forme di GSTO, la GSTO1 e la GSTO2 (Whitbread A.K. & al., 2003). Entrambe sono localizzate sul cromosoma 10, sono costituite da 6 esoni, possiedono nel sito attivo una cisteina in posizione 32 e all¡¯estremit¨¤ terminale una coda di 19 amminoacidi con caratteristiche peculiari di questa classe di GST (Whitbread A.K. & al., 2003). E¡¯ noto che altre GST e shock protein vengono indotte dal TNF-¦Á e dall¡¯aumento della densit¨¤ cellulare (Mehlen P. & al., 1995; Garrido C. & al., 1997; Morceau F. & al., 2004). Abbiamo quindi deciso di adottare questi modelli sperimentali al fine di studiare i possibili meccanismi di regolazione dell¡¯espressione della GSTO1 e della GSTO2. Le linee cellulari utilizzate sono state due: una linea cellulare di melanoma umano Me665/2/21 e la linea cellulare U937. Le due linee cellulari differiscono per le modalit¨¤ di crescita: la prima (Me665/2/21) cresce adesa al substrato, mentre la seconda (U937) cresce in sospensione. L¡¯analisi mediante di Immunoblotting su cellule di melanoma umano Me665/2/21 ha dimostrato come, in entrambi i modelli sperimentali, sia possibile osservare un aumento dell¡¯espressione della GSTO. Il siero anti-GSTO1, attualmente in uso, non permette per¨° di distinguere tra le due forme (GSTO1 e GSTO2), perch¨¦ interagisce anche con la GSTO2. Ulteriori indagini, condotte mediante tecniche di RT-PCR hanno permesso di dimostrare che il trattamento con il TNF-¦Á provoca un aumento del solo mRNA della GSTO1, mentre l¡¯aumento della densit¨¤ cellulare induce un aumento del solo mRNA della GSTO2. E¡¯ noto che molti effetti della stimolazione con TNF-¦Á sono mediati dall¡¯attivazione del fattore nucleare NFkB (Delhalle S., et al. 2004). Tale attivazione ¨¨ stata confermata anche nel nostro modello sperimentale tramite EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Esperimenti condotti mediante Immunoblotting, impiegando il partenolide (inibitore di NFkB (Delhalle S., et al. 2004)), hanno mostrato che l¡¯inibizione dell¡¯attivazione di NFkB blocca anche l¡¯aumento della GSTO (valutato tramite Immunoblotting) indotto dal TNF-¦Á. Questi dati fanno pertanto supporre che il gene per la GSTO1 faccia parte del pattern di geni la cui trascrizione ¨¨ regolata da NFkB. Per quanto riguarda l¡¯induzione della GSTO2 all¡¯aumentare del grado di densit¨¤ cellulare, tale induzione si osserva nelle cellule di melanoma, ma non nelle U937 che crescono in sospensione. In entrambe le linee cellulari non si osserva attivazione di NFkB all¡¯aumentare della densit¨¤ cellulare. Questi dati fanno supporre che l¡¯induzione della GSTO2 non dipenda dal semplice aumento del numero di cellule, ma da altri fenomeni legati alla confluenza cellulare quali l¡¯adesione al substrato, l¡¯aumento delle giunzioni intercellulari, l¡¯arresto del ciclo cellulare, etc

Studio del ruolo dell'inositolo nella riproduzione assistita

Il mioinositolo è un isomero dello zucchero alcolico C6 appartenente alle vitamine del gruppo B. Numerosi studi hanno suggerito che il mioinositolo svolga un ruolo importante nella morfogenesi e citogenesi cellulare, nella sintesi dei lipidi, nella struttura delle membrane cellulari e nella crescita cellulare. In particolare, è stato dimostrato che il mioinositolo sia il precursore della sintesi dei fosfoinosidi. Esso è quindi alla base del sistema di trasduzione del fosfatidilinositolo, noto per essere coinvolto nella regolazione di diverse funzioni cellulari, compresa la proliferazione cellulare. La presenza del mioinositolo nei fluidi corporei umani, il suo ruolo quale precursore dei fosfolipidi a base di inositolo, responsabili di segnali intracellulari essenziali per lo sviluppo degli ovociti, e il suo effetto nel migliorare la maturazione degli ovociti ha suggerito che possa esistere una relazione tra la concentrazione del mioinositolo nel fluido follicolare e la qualità degli ovociti che possono essere prodotti. Sulla base di queste premesse, l‟obiettivo della presente tesi è quello di illustrare e discutere i progressi compiuti di recente in merito all‟impiego del mioinositolo nella fecondazione assistita ed in special modo gli effetti che esso induce sulla risposta ovarica e sulla qualità ovocitaria nelle pazienti affette da sindrome dell‟ovaio policistico e sottoposte a induzione dell‟ovulazione ed inseminazione in vitro tramite l‟iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI)

Tocilizumab for patients with COVID-19 pneumonia. The single-arm TOCIVID-19 prospective trial

BackgroundTocilizumab blocks pro-inflammatory activity of interleukin-6 (IL-6), involved in pathogenesis of pneumonia the most frequent cause of death in COVID-19 patients.MethodsA multicenter, single-arm, hypothesis-driven trial was planned, according to a phase 2 design, to study the effect of tocilizumab on lethality rates at 14 and 30 days (co-primary endpoints, a priori expected rates being 20 and 35%, respectively). A further prospective cohort of patients, consecutively enrolled after the first cohort was accomplished, was used as a secondary validation dataset. The two cohorts were evaluated jointly in an exploratory multivariable logistic regression model to assess prognostic variables on survival.ResultsIn the primary intention-to-treat (ITT) phase 2 population, 180/301 (59.8%) subjects received tocilizumab, and 67 deaths were observed overall. Lethality rates were equal to 18.4% (97.5% CI: 13.6-24.0, P=0.52) and 22.4% (97.5% CI: 17.2-28.3, P<0.001) at 14 and 30 days, respectively. Lethality rates were lower in the validation dataset, that included 920 patients. No signal of specific drug toxicity was reported. In the exploratory multivariable logistic regression analysis, older age and lower PaO2/FiO2 ratio negatively affected survival, while the concurrent use of steroids was associated with greater survival. A statistically significant interaction was found between tocilizumab and respiratory support, suggesting that tocilizumab might be more effective in patients not requiring mechanical respiratory support at baseline.ConclusionsTocilizumab reduced lethality rate at 30 days compared with null hypothesis, without significant toxicity. Possibly, this effect could be limited to patients not requiring mechanical respiratory support at baseline.Registration EudraCT (2020-001110-38); clinicaltrials.gov (NCT04317092)