Study of the interactions of IL-2 and -15 receptors on human T lymphoma cells

A membránfehérjékből felépülő sejtfelszíni struktúrák változatos térbeli és időbeli szerkezettel rendelkeznek, több hierarchikus szinten szerveződnek. Az immunfolyamatokban fontos szereppel rendelkező interleukin-2 és -15 citokin receptorok és az MHC I és II molekulák közös klaszterekben fejeződnek ki T sejtek membránjában. Kíváncsiak voltunk arra, hogy a legmagasabb expressziójú komponens, az MHC I hogyan befolyásolja a klaszter elemeinek aggregációját és dinamikáját. Ezért az MHC I expresszióját siRNS-sel csendesítettük. Szuperfelfodású képek analízisével kimutattuk, hogy az MHC I molekulák klasztermérete azok expressziós szintjének a függvénye. Az IL-2Rα és IL-15Rα alegységek klaszterizációját, valamint az IL-2/15Rβ és IL-2Rα közötti átlagos távolságot az MHC I csendesítése nem befolyásolta. Molekuláris fényességek analízisével kimutattuk, hogy a kisméretű MHC I komplexekben a homoaggregáció mértéke csökkent az expressziós szint csökkentésével. FCS mérések segítségével megállapítottuk, hogy az MHC I molekulák mobilitása következetesen nagyobb a kölcsönható fehérjék által alkotott aggregátum méretének csökkentésével. Az IL-2/15Rα alegységek mobilitása is megnőtt az MHC I számának a csökkentésével. Az MHC I és az IL-2Rα/IL-15Rα stabil kölcsönhatása következtében a géncsendesítés után megmaradó MHC I molekulák az IL-2Rα/IL-15Rα alegységek mellett maradtak. A receptorok lipid tutajokban való akkumulációjára nem volt hatással a géncsendesítés. Értekezésem további részében az IL-2 jelútvonalban is szerepet játszó c-Jun és a c-Fos heterodimer transzkripciós faktorok konformációját és dinamikus sajátságait vizsgáltam meg. A dimerek konformációjának vizsgálatához a C-végükön elhelyezkedő fluoreszcens fehérjék között FRET méréseket végeztünk, a DNS-kötődés vizsgálatát fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópiás (FCCS) analízis segítségével végeztük el. Megállapítottuk, hogy DNS-hez kötött dimer transzkripciós faktorok aránya csökkent, ha a c-Fos C-terminális végét megrövidítettük, tehát a C terminális régiónak funkciója van a DNS-hez való kötődésben. A FRET adatok alapján számolt átlagos távolságok ismeretében a molekuláris dinamikai szimulációkból számolt lehetséges konformációk körét jelentősen szűkíteni lehetett. Az értekezés utolsó részében egy újraprogramozható mérőeszköz (FPGA) biofizikai mérésekben való lehetséges alkalmazását, illetve validálását mutattam be fluoreszcencia (kereszt)korrelációs mérésekben. Az eszközzel, valamint a kereskedelmi forgalomban kapható korrelátorral meghatározott korrelációs függvények paraméterbecslését nemlineáris illesztéssel végeztem el, a paraméterek a két eszközön közel azonosak voltak. Az eszköz segítségével megbecsülhető a molekulakomplexekben levő fehérjék asszociált hányada és mobilitása, lehetővé téve pontosabb biofizikai modellek felállítását.Membrane proteins form dynamic clusters at different hierarchical levels. MHC I and II glycoproteins and interleukin-2 and -15 receptors, which are all important players in immunological processes, form supramolecular clusters in lipid rafts of T cells. The role of the highly expressed MHC glycoproteins in these complexes has not been elucidated, we were interested in finding the effect of gene silencing of MHC I glycoproteins on the dynamics and clustering of MHC I and IL-2Rα/IL-15Rα. The expression level of MHC I was reduced using anti-β2m siRNA. Combination of superresolution microscopy with image analysis methods showed that the diameter of MHC I superclusters significantly reduced, whereas those of IL-2Rα/IL-15Rα hardly changed upon gene silencing. Fluorescence correlation spectroscopy-based brightness analysis revealed that the molecular level of homoaggregation of MHC I molecules was reduced by decreasing their expression level. The mobility of IL-2Rα, IL-15Rα and MHC I increased significantly upon knockdown of MHC I, corroborating the general size decrease of protein aggregates. MHC I molecules retracted to a smaller total area, but remained in the vicinity of interleukin receptors. The interaction between IL-2Rα and IL-2/15Rβ subunits did not change significantly, suggesting that the interactions holding these subunits together were not dependent on the presence of MHC I. Our colocalization analyses suggested that the enrichment of IL-2Rα/IL-15Rα in lipid rafts was not affected by removing MHC I molecules. In the second part of the dissertation the dynamics and conformation of heterodimer-forming c-Jun and c-Fos transcription factors, which are part of the signaling pathway of IL-2, were analyzed. The conformation of the dimers was analyzed by FRET measurements between the fluorescently labeled C-termini of Jun and Fos proteins. Two-color cross-correlation analysis was used to assess co-mobility and DNA binding of the constructs. The data showed that the fraction of DNA-bound dimers decreased if we truncated the C-terminus of c-Fos, suggesting that the C-terminal end may play a role in the stabilization of the DNA-binding of the transcription factors. The average distances of the C-termini derived from our FRET measurements allowed us to narrow down the range of possible conformations of the Fos-Jun dimer predicted by molecular dynamic simulations. Finally, an application of a reprogrammable hardware device (FPGA) in biophysical measurements, and its validation were presented in fluorescence (cross)correlation experiments. The correlation functions calculated by our commercial correlator and the FPGA correlator overlapped perfectly and yielded practically identical fit parameters. By using this hardware, the associated fraction of diffusing molecules and their co-mobility can be quantified, allowing the establishment of more precise biophysical models.N

Az interleukin-15 receptor molekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata humán sejtvonalakon = Investigation of molecular interactions of interleukin-15 receptor on human cell lines

Az IL-15 citokin fontos szerepet játszik a T sejtek működésében és homeosztázisában. Receptora felépítésében a citokin-specifikus alfa lánc és az IL-2R felépítésében is részt vevő béta és gamma alegység vesz részt. Modern biofizikai módszerekkel (FRET, CLSM, FCS, NSOM stb.) vizsgáltuk az IL-15R összeszerelődését és sejtfelszíni elrendeződését humán T sejteken. Kimutattuk, hogy a Kit225 FT7.10 humán T limfóma eredetű sejteken a magas affinitású heterotrimer IL-15R komplex előre összeszerelt állapotban van jelen. Korábban hasonló eredményt kaptunk a heterotrimer IL-2 receptorra vonatkozóan. Igazoltuk a két alfa alegység molekuláris kolokalizációját és együttes laterális diffúzióját, ami asszociációjuk stabil voltára utal (legalábbis a néhány 10 ms-os időskálán). Eredményeink alapján megalkottuk az IL-2/15R rendszer dinamikus heterotetramer modelljét: a releváns citokin kötődése a receptor alegységek átrendezésével alakítja ki a megfelelő nagy affinitású heterotrimert. Kimutattuk, hogy az IL-15Ralfa és az IL-2Ralfa nagyméretű (néhány 100 nm-es) domének mellett kisméretű, csak néhány molekulából álló klaszterekben (vagy akár egyedi molekulaként) is megtalálható a vizsgált T limfóma sejteken. Kimutattuk, hogy az IL-2/15R és az MHC molekulák közös szuperklasztereket alkotnak a T sejtek lipid tutajaiban. Ezen klasztereket mind sejtvonalakon, mind pedig klinikai mintákból származó primer T sejteken azonosítottuk. Kimutattuk, hogy a szöveti környezet módosíthatja a mintázatokat. | IL-15 plays an important role in T cell homeostasis and function. Its receptor consists of the cytokine-specific alpha chain and the beta and gamma subunits, also utilized by IL-2R. By using modern biophysical methods (FRET, CLSM, FCS, NSOM) we have studied assembly and cell surface organization of IL-15R in human T cells. It was demonstrated that similar to the heterotrimeric IL-2R, the high affinity heterotrimeric IL-15R complex is preassembled even in the absence of its ligand in Kit225 Ft7.10 cells. We have shown co-localization of the two alpha chains at the molecular level, as well as their co-mobility indicating stability of their association (at least at the time scale of several tens of milliseconds). Based on our data, we have envisaged a dynamic heterotetrameric model of the IL-2/15R system, where binding of the appropriate cytokine rearranges receptor subunits to form the appropriate high-affinity receptor trimer. In addition to large clusters (several hundreds nanometers), we have revealed that IL-15Ralpha and IL-2Ralpha may also exist in small clusters (or even as monomers) at the surface of studied T cells. We have shown that IL-2/15R and MHC glycoproteins form supramolecular clusters in lipid rafts of T cells. These motifs were identified in cell lines as well as in primer T cells derived form clinical samples. We have shown that tissue environment can rearrange these protein patterns

Sejtfelszíni és magreceptorok többszörös asszociációjának és dinamikájának vizsgálata fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia és energia transzfer segítségével = Examination of the multiple association and dynamics of cell surface and nuclear receptors by fluorescence correlation spectroscopy and energy transfer

Az interleukin-2 és -15 citokinek fontos szerepet játszanak a T sejtek funkciójának és homeosztázisának szabályozásában. A pályázat keretében az IL-2/15R komplex összeszerelődését, sejtfelszíni elrendeződését és más membránfehérjékkel kialakított kölcsönhatásait tanulmányoztuk humán T sejtek felszínén. Igazoltuk, hogy az MHC I glikoproteinek szervező szerepet játszanak az IL-2/15R klaszterek összeszerelődésében. Az IL-2/15R és az MHC I/II glikoproteinek által alkotott klaszterek stabilitása nem függ jelentős mértékben a citoszkeletontól, az asszociációk apoptotikus blebek felszínén is megmaradnak. Jellemeztük az ILRAP - egy IL-2R-rel asszociálódó fehérje molekuláris kölcsönhatásait, ami hozzájárulhat az IL-2/IL-15 eltérő hatásspektrumának magyarázatához. Közvetlen bizonyítékát adtuk az IL-15 transz prezentációjának két T limfóma sejttípus között. Kidolgoztunk egy megbízható módszert, mellyel GFP és mRFP között lehet FRET méréseket végezni. FRET, FCCS és modellezés segítségével leírtuk a Jun-Fos komplex C terminális konformációját, ami a működésre vonatkozó felvetéseket is eredményezett. RXR és RAR magreceptorok és funkcionális mutánsaik mobilitását vizsgálva megállapítottuk, hogy a magreceptorok ligand hiányában ? ellentétben a jelenleg elfogadott molekuláris kapcsoló modellel ? nagyrészt szabad állapotban vannak. Agonista hatására részleges átrendeződés történik egy alacsony mobilitású állapotba, amelyben a receptor feltehetően koaktivátort köt, és DNS-kötő affinitása megnő. | Interleukin-2 and -15 play an important role in regulating the function and homeostasis of T cell function. In our research we investigated the assembly, cell surface organization and interactions of the IL-2/15R complex with other membrane proteins in human T cells. We showed that MHC I glycoproteins play an organizing role in the assembly of IL-2/15R clusters. The stability of clusters formed by IL-2/15R and MHCI/II proteins does not critically depend on the cytoskeleton, associations remain stable on the surface of apoptotic blebs as well. We characterized the interactions of ILRAP, an IL-2R-associated protein, which may contribute to understanding the distinct effects of IL-2 and IL-15. We gave direct evidence of the trans presentation of IL-15 between two T lymphoma cell types. We elaborated a method for the measurement of FRET between GFP and mRFP. By using FRET, FCCS and MD-modeling the C terminal conformation of the Jun-Fos complex was characterized, which yielded implications for their mode of action. By measuring the mobility of RXR and RAR nuclear receptors and their functional mutants we demonstrated that receptors are in a freely diffusing state in the absence of ligand, which is in contrast to expectations of the molecular switch model. Agonist treatment yields a shift to a less mobile state, in which the receptor probably binds coactivator and has an increased DNA-binding affinity

Doxorubicin induces large-scale and differential H2A and H2B redistribution in live cells

K

FPGA implementation of a 32x32 autocorrelator array for analysis of fast image series

With the evolving technology in CMOS integration, new classes of 2D-imaging detectors have recently become available. In particular, single photon avalanche diode (SPAD) arrays allow detection of single photons at high acquisition rates (\geq 100 kfps), which is about two orders of magnitude higher than with currently available cameras. Here we demonstrate the use of a SPAD array for imaging fluorescence correlation spectroscopy (imFCS), a tool to create 2D maps of the dynamics of fluorescent molecules inside living cells. Time-dependent fluorescence fluctuations, due to fluorophores entering and leaving the observed pixels, are evaluated by means of autocorrelation analysis. The multi-{\tau} correlation algorithm is an appropriate choice, as it does not rely on the full data set to be held in memory. Thus, this algorithm can be efficiently implemented in custom logic. We describe a new implementation for massively parallel multi-{\tau} correlation hardware. Our current implementation can calculate 1024 correlation functions at a resolution of 10{\mu}s in real-time and therefore correlate real-time image streams from high speed single photon cameras with thousands of pixels.Comment: 10 pages, 7 figure

Thermogenic Activation Downregulates High Mitophagy Rate in Human Masked and Mature Beige Adipocytes

L

Human abdominal subcutaneous-derived active beige adipocytes carrying FTO rs1421085 obesity-risk alleles exert lower thermogenic capacity

Introduction: White adipocytes store lipids, have a large lipid droplet and few mitochondria. Brown and beige adipocytes, which produce heat, are characterized by high expression of uncoupling protein (UCP) 1, multilocular lipid droplets, and large amounts of mitochondria. The rs1421085 T-to-C single-nucleotide polymorphism (SNP) of the human FTO gene interrupts a conserved motif for ARID5B repressor, resulting in adipocyte type shift from beige to white.Methods: We obtained abdominal subcutaneous adipose tissue from donors carrying FTO rs1421085 TT (risk-free) or CC (obesity-risk) genotypes, isolated and differentiated their preadipocytes into beige adipocytes (driven by the PPARγ agonist rosiglitazone for 14 days), and activated them with dibutyryl-cAMP for 4 hours. Then, either the same culture conditions were applied for additional 14 days (active beige adipocytes) or it was replaced by a white differentiation medium (inactive beige adipocytes). White adipocytes were differentiated by their medium for 28 days.Results and Discussion: RNA-sequencing was performed to investigate the gene expression pattern of adipocytes carrying different FTO alleles and found that active beige adipocytes had higher brown adipocyte content and browning capacity compared to white or inactive beige ones when the cells were obtained from risk-free TT but not from obesity-risk CC genotype carriers. Active beige adipocytes carrying FTO CC had lower thermogenic gene (e.g., UCP1, PM20D1, CIDEA) expression and thermogenesis measured by proton leak respiration as compared to TT carriers. In addition, active beige adipocytes with CC alleles exerted lower expression of ASC-1 neutral amino acid transporter (encoded by SLC7A10) and less consumption of Ala, Ser, Cys, and Gly as compared to risk-free carriers. We did not observe any influence of the FTO rs1421085 SNP on white and inactive beige adipocytes highlighting its exclusive and critical effect when adipocytes were activated for thermogenesis

The voltage-gated proton channel hHv1 is functionally expressed in human chorion-derived mesenchymal stem cells

L

Palmitate Inhibits Mouse Macrophage Efferocytosis by Activating an mTORC1-Regulated Rho Kinase 1 Pathway: Therapeutic Implications for the Treatment of Obesity

Every day, billions of our cells die and get cleared without inducing inflammation. When, clearance is improper, uncleared cells undergo secondary necrosis and trigger inflammation. In addition, proper efferocytosis would be required for inducing resolution of inflammation, thus clearance deficiencies in the long term lead to development of various chronic inflammatory diseases. Increasing evidence indicates that obesity, itself being a low-grade inflammatory disease, predisposes to a variety of other chronic inflammatory diseases. Previous studies indicated that this later might be partially related to an impaired efferocytosis induced by increased uptake of circulating saturated fatty acids by macrophages in obese people. Here, we show that palmitate inhibits efferocytosis by bone marrow-derived macrophages in a dose-dependent manner. Palmitate triggers autophagy but also activates an energy-sensing mTORC1/ROCK1 signaling pathway, which interferes with the autophagosome–lysosome fusion, resulting in accumulation of the cellular membranes in autophagosomes. We propose that lack of sufficient plasma membrane supply attenuates efferocytosis of palmitate-exposed macrophages. AMP-activated protein kinase activators lead to mTORC1 inhibition and, consequently, released the palmitate-induced efferocytosis block in macrophages. Thus, they might be useful in the treatment of obesity not only by affecting metabolism thought so far. ROCK1 inhibitors could also be considered