Untersuchungen zur Funktion endothelialer Transkriptionsfaktoren bei der Angiogenese

Mit Hilfe des Cre-loxP Rekombinationssystems können Gene zelltypspezifisch inaktiviert werden. Hier wurden die genregulatorischen Elemente des flk-1 Gens mit dem Cre Rekombinase Gen fusioniert und transgene Mauslinien etabliert (flk-1-Cre). Diese Mäuse wurden mit der Reportermauslinie Rosa26R gekreuzt, so dass in doppelt transgenen Nachkommen die Cre Aktivität durch LacZ-Färbung analysiert werden konnte. Die Untersuchung von flk-1-Cre/ Rosa26R Embryonen und adulten Tieren zeigte eine spezifische Färbung der Endothelzellen von Blutgefäßen in fast allen Organsystemen. Außerdem wurde die Cre Expression in Gefäßen von experimentellen BFS-1 Tumoren nachgewiesen. Flk-1-Cre Mauslinien können in Zukunft verwendet werden, um gefloxte Zielgene spezifisch in Endothelzellen zu inaktivieren. Die Rolle von Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) in der embryonalen Gefäßentwicklung wurde untersucht, indem HIF Signalwege im Endothel blockiert wurden. Dazu wurde eine dominant negative HIF2-alpha Mutante verwendet (HIFdn), die mittels der regulatorischen Elemente des flk-1 Gens spezifisch in Endothelzellen von transgenen Mausembryonen exprimiert wurde. Die HIFdn transgenen Embryonen zeigten eine Wachstumsretardierung und starben an Tag 11,5 der Embryonalentwicklung. In den transgenen Embryonen wurden primitive Gefäßstrukturen gebildet, was auf eine normale Vaskulogenese hinwies. Diese unreifen Gefäße wurden aber nicht remodelliert, da keine sprossende Angiogenese auftrat. In Herzen von HIFdn transgenen Embryonen zeigten sich Defekte in der Bildung von Trabekeln und in der Ausbildung der Herzschleife. Die Analyse der Genexpression zeigte, dass endotheliale Gene wie tie-2, flt-1 und flk-1 in transgenen Embryonen stark reduziert waren. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass endotheliale HIF eine essentielle Rolle in der embryonalen Angiogenese spielen. Die Regulation des humanen VEGF Rezeptor-2 Gens (KDR) wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor HIF2-alpha, nicht aber der verwandte HIF1-alpha die Aktivität des KDR Promotors in Reportergenexperimenten stimulierte. Potentielle HIF2 Bindungsstellen im KDR Promotor wurden identifiziert. Durch die Mutation einer dieser Bindungsstellen wurde die Aktivierbarkeit des Promotors stark reduziert. Im Vergleich zum Mausgen, zeigte das 1. Intron des humanen KDR Gens eine Region großer Sequenzidentität. Im Mausgen enthält diese Region („Enhancer“) Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und sie ist essentiell für die endothelspezifische Expression in vivo. Die Bindungsstellen für diese Transkriptionsfaktoren (SCL/Tal-1, Gata, Ets) sind im 1. Intron des humanen Gens konserviert, so dass sie wahrscheinlich an der Regulation der Genexpression beteiligt sind

Untersuchungen zur Funktion endothelialer Transkriptionsfaktoren bei der Angiogenese

Mit Hilfe des Cre-loxP Rekombinationssystems können Gene zelltypspezifisch inaktiviert werden. Hier wurden die genregulatorischen Elemente des flk-1 Gens mit dem Cre Rekombinase Gen fusioniert und transgene Mauslinien etabliert (flk-1-Cre). Diese Mäuse wurden mit der Reportermauslinie Rosa26R gekreuzt, so dass in doppelt transgenen Nachkommen die Cre Aktivität durch LacZ-Färbung analysiert werden konnte. Die Untersuchung von flk-1-Cre/ Rosa26R Embryonen und adulten Tieren zeigte eine spezifische Färbung der Endothelzellen von Blutgefäßen in fast allen Organsystemen. Außerdem wurde die Cre Expression in Gefäßen von experimentellen BFS-1 Tumoren nachgewiesen. Flk-1-Cre Mauslinien können in Zukunft verwendet werden, um gefloxte Zielgene spezifisch in Endothelzellen zu inaktivieren. Die Rolle von Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) in der embryonalen Gefäßentwicklung wurde untersucht, indem HIF Signalwege im Endothel blockiert wurden. Dazu wurde eine dominant negative HIF2-alpha Mutante verwendet (HIFdn), die mittels der regulatorischen Elemente des flk-1 Gens spezifisch in Endothelzellen von transgenen Mausembryonen exprimiert wurde. Die HIFdn transgenen Embryonen zeigten eine Wachstumsretardierung und starben an Tag 11,5 der Embryonalentwicklung. In den transgenen Embryonen wurden primitive Gefäßstrukturen gebildet, was auf eine normale Vaskulogenese hinwies. Diese unreifen Gefäße wurden aber nicht remodelliert, da keine sprossende Angiogenese auftrat. In Herzen von HIFdn transgenen Embryonen zeigten sich Defekte in der Bildung von Trabekeln und in der Ausbildung der Herzschleife. Die Analyse der Genexpression zeigte, dass endotheliale Gene wie tie-2, flt-1 und flk-1 in transgenen Embryonen stark reduziert waren. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass endotheliale HIF eine essentielle Rolle in der embryonalen Angiogenese spielen. Die Regulation des humanen VEGF Rezeptor-2 Gens (KDR) wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor HIF2-alpha, nicht aber der verwandte HIF1-alpha die Aktivität des KDR Promotors in Reportergenexperimenten stimulierte. Potentielle HIF2 Bindungsstellen im KDR Promotor wurden identifiziert. Durch die Mutation einer dieser Bindungsstellen wurde die Aktivierbarkeit des Promotors stark reduziert. Im Vergleich zum Mausgen, zeigte das 1. Intron des humanen KDR Gens eine Region großer Sequenzidentität. Im Mausgen enthält diese Region („Enhancer“) Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und sie ist essentiell für die endothelspezifische Expression in vivo. Die Bindungsstellen für diese Transkriptionsfaktoren (SCL/Tal-1, Gata, Ets) sind im 1. Intron des humanen Gens konserviert, so dass sie wahrscheinlich an der Regulation der Genexpression beteiligt sind

JunB is required for endothelial cell morphogenesis by regulating core-binding factor β

The molecular mechanism triggering the organization of endothelial cells (ECs) in multicellular tubules is mechanistically still poorly understood. We demonstrate that cell-autonomous endothelial functions of the AP-1 subunit JunB are required for proper endothelial morphogenesis both in vivo in mouse embryos with endothelial-specific ablation of JunB and in in vitro angiogenesis models. By cDNA microarray analysis, we identified core-binding factor β (CBFβ), which together with the Runx proteins forms the heterodimeric core-binding transcription complex CBF, as a novel JunB target gene. In line with our findings, expression of the CBF target MMP-13 was impaired in JunB-deficient ECs. Reintroduction of CBFβ into JunB-deficient ECs rescued the tube formation defect and MMP-13 expression, indicating an important role for CBFβ in EC morphogenesis

Advances in our understanding of the pathogenesis of glomerular thrombotic microangiopathy

Glomerular thrombotic microangiopathy is a hallmark feature of haemolytic uraemic syndrome, the leading cause of acute renal failure in childhood. This paper is a review of the different mechanistic pathways that lead to this histological picture in the kidney. It will focus on atypical HUS and complement dysregulation, but will also highlight some other recent advances in our understanding of this condition, including the potential role of the molecule vascular endothelial growth factor- A (VEGF-A)

Mathematical Model of Plasmid-Mediated Resistance to Ceftiofur in Commensal Enteric Escherichia coli of Cattle

Antimicrobial use in food animals may contribute to antimicrobial resistance in bacteria of animals and humans. Commensal bacteria of animal intestine may serve as a reservoir of resistance-genes. To understand the dynamics of plasmid-mediated resistance to cephalosporin ceftiofur in enteric commensals of cattle, we developed a deterministic mathematical model of the dynamics of ceftiofur-sensitive and resistant commensal enteric Escherichia coli (E. coli) in the absence of and during parenteral therapy with ceftiofur. The most common treatment scenarios including those using a sustained-release drug formulation were simulated; the model outputs were in agreement with the available experimental data. The model indicated that a low but stable fraction of resistant enteric E. coli could persist in the absence of immediate ceftiofur pressure, being sustained by horizontal and vertical transfers of plasmids carrying resistance-genes, and ingestion of resistant E. coli. During parenteral therapy with ceftiofur, resistant enteric E. coli expanded in absolute number and relative frequency. This expansion was most influenced by parameters of antimicrobial action of ceftiofur against E. coli. After treatment (>5 weeks from start of therapy) the fraction of ceftiofur-resistant cells among enteric E. coli, similar to that in the absence of treatment, was most influenced by the parameters of ecology of enteric E. coli, such as the frequency of transfer of plasmids carrying resistance-genes, the rate of replacement of enteric E. coli by ingested E. coli, and the frequency of ceftiofur resistance in the latter

Phenolic excipients of insulin formulations induce cell death, pro-inflammatory signaling and MCP-1 release

Skin reactions at the infusion site are a common side effect of continuous subcutaneous insulin infusion therapy. We hypothesized that local skin complications are caused by components of commercial insulin formulations that contain phenol or m-cresol as excipients. The toxic potential of insulin solutions and the mechanisms leading to skin reactions were explored in cultured cells. The toxicity of insulin formulations (Apidra, Humalog, NovoRapid, Insuman), excipient-free insulin, phenol and m-cresol was investigated in L929 cells, human adipocytes and monocytic THP-1 cells. The cells were incubated with the test compounds dose- and time-dependently. Cell viability, kinase signaling pathways, monocyte activation and the release of pro-inflammatory cytokines were analyzed. Insulin formulations were cytotoxic in all cell-types and the pure excipients phenol and m-cresol were toxic to the same extent. P38 and JNK signaling pathways were activated by phenolic compounds, whereas AKT phosphorylation was attenuated. THP-1 cells incubated with sub-toxic levels of the test compounds showed increased expression of the activation markers CD54, CD11b and CD14 and secreted the chemokine MCP-1 indicating a pro-inflammatory response. Insulin solutions displayed cytotoxic and pro-inflammatory potential caused by phenol or m-cresol. We speculate that during insulin pump therapy phenol and m-cresol might induce cell death and inflammatory reactions at the infusion site in vivo. Inflammation is perpetuated by release of MCP-1 by activated monocytic cells leading to enhanced recruitment of inflammatory cells. To minimize acute skin complications caused by phenol/m-cresol accumulation, a frequent change of infusion sets and rotation of the infusion site is recommended

Treatment with human complement factor H rapidly reverses renal complement deposition in factor H-deficient mice

Total deficiency of complement factor H (CFH) is associated with dense deposit disease and atypical hemolytic uremic syndrome. CFH is the major regulator of the alternative pathway of complement activation and its complete deficiency results in uncontrolled C3 activation through this pathway and secondary C3 deficiency. Plasma infusion, as a source of CFH, has been used with variable success to treat renal disease associated with its deficiency. However, the risks of volume and protein overload limit this therapeutic approach. In this study, we investigated the efficacy of a purified human CFH (hCFH) preparation in Cfh-gene knockout mice. These mice spontaneously develop both secondary plasma C3 deficiency and a renal abnormality characterized by massive accumulation of C3 along the glomerular basement membrane. The renal lesion is analogous to human dense deposit disease. Treatment of knockout mice with hCFH resulted in rapid normalization of plasma C3 levels and resolution of the glomerular basement membrane C3 deposition. Long-term treatment of mice with hCFH was not possible because of the development of an immune response against hCFH. Hence, we suggest that hCFH can be an effective alternative therapy to plasma infusions in patients with renal disease associated with CFH deficiency