Analysis of nuclear FK506-binding protein(FKBP)

免疫抑制剤FK506に結合する蛋白質であるFKBP(FK506−binding protein)は、原核細胞生物から真核細胞生物まで殆どの生物種に存在しており、生体内の機能分子である蛋白質の主鎖の向きを大きく変換することのできる酵素活性(peptidyl prolyl cis/trans isomerase (PPIase)活性)を有している。またFKBPはファミリーを形成し、それぞれが核・細胞質・小胞体など細胞内の多様な場所に局在していることから、多様な蛋白質の構造変換に関与していると考えられる。//　一方、染色体から遺伝情報がどのように読みとれるのかを解明することは、生体反応の基本的課題である。染色体DNAは、ヒストンなどの蛋白質と共にクロマチン構造を形成することによって、DNAの情報が必要でない時に読まれるのを抑制しており、染色体DNAの情報が発現するには、クロマチン構造を変換する必要がある。//　FKBPが蛋白質の構造を大きく変換できる活性を有していることに着目し、核型FKBPを新規に単離し、クロマチン構造変換に作用しているかを検証した。本研究は、核型のPPIaseが蛋白質構造変換活性のみならずクロマチン構造変換活性を有するということを初めて示したものであり、高次クロマチン構造変換機構に新局面を切り開くものである。//I.核型FKBPの単離と「構造と局在性のルール」//　転写基本因子TFIIDの相互作用因子としてヒトFKBPを単離し、さらに遺伝学的・生化学的な解析が可能である酵母の新規核型FKBPも単離した。その過程で、多様なFKBPファミリーの一次構造・三次構造と細胞内局在性の間に規則性があることを見出した。//1.PPIaseドメインと局在性//　FKBPファミリーは細胞内の多様な場所に存在することから、多様な場所で多様な基質を認識すると考えられる。そこで、これらFKBPファミリーが持つPPIaseドメインの系統樹を作成し分類したところ、細胞内局在による分類と一致することを見出した。さらに、それぞれのグループに特異的なアミノ酸が存在することを見出した。グループ特異的なアミノ酸は一次構造上分散していたが、それらを立体構造上にマップすると、まとまって存在していることが判明した。新規に単離したFKBPが核局在性を示すことがこのルールから予想されたので、蛍光抗体法により検討したところ、実際に核に局在していることが判明し、予測が実証された。//2.PPIaseドメイン以外のドメインと局在性//　次にPPIaseドメイン以外のドメイン領域に注目したところ、PPlaseドメインで分類したグループに対応して、付加的なドメインの構造的特徴が分類されることがわかった。核局在型はN末領域に長いドメインを有する。その領域には、進化的高保存ドメイン、高酸性ドメイン、高塩基性ドメインなどが見出された。高保存ドメインには対応した特定の相互作用因子の存在が考えられる。高酸性および高塩基性ドメインのそれぞれの相互作用相手として、塩基性物質であるヒストンや酸性物質であるDNAなどが考えられ、核型FKBPはDNAやヒストンからなるヌクレオソームに相互作用して働くのではないかと考えた。//II.核型FKBPはヒストンシャペロン活性を有する//1.ヒストン依存スーパーコイリング活性//　前述の理由から、核型FKBPのヒストンとDNAへの相互作用を想定し、ヒストンとDNAから形成されるヌクレオソーム構造の形成活性に核型FKBPは関与するのではないかと考え、ヒストン依存スーパーコイリング活性を検討したところ、ヒストン依存に活性が見出された。この活性は核型FKBPとヒストンが1:1の分子濃度で飽和する反応性を示したことから、ヒストンとの相互作用活性を中心とした化学当量論的な反応に由来すると考えられた。//2.ヌクレオソームアレイ活性(Mnaseアッセイ)//　核型FKBPによってヌクレオソームアレイが形成されるか否かを、MNaseによるリンカーDNA切断を通してヒストン・DNA相互作用部位のDNAの長さを測ることにより検討した。その結果、1個もしくは2個のヌクレオソーム様構造に対応するDNAが観察された。1,2両活性により、核型FKBPがヒストンシャペロン活性を有すると結論づけた。//3.新しいタイプのヒストンシャペロン活性//　従来のヒストンシャペロンが主に酸性蛋白質であるのとは異なり、核型FKBPは高塩基性領域と酵素領域を有することから、ヒストンシャペロン活性としての作用機構も従来のヒストンシャペロンとは異なることが予想された。そこで反応素段階を検討したところ、NAP1を代表とする従来のヒストンシャペロンとは異なり、ヒストンとの前処理を必要としなかった。このことは、従来とは性質の異なる新しいタイプのヒストンシャペロンであることを示している。//4.ヒストンシャペロンドメインとPPIaseドメインの独立性//　核型FKBPのヒストンシャペロン活性がどのドメインにより担われているかを(1)核型特異的活性、(2)PPIase活性阻害、(3)欠失変異体を用いて検定した。//　(1)FKBPのヒストンシャペロン活性が核型特異的かどうかを検討した。細胞質型FKBPと核型FKBPを用いて、ヒストンシャペロン活性を検討したところ、細胞質型FKBPにはヒストンシャペロン活性はなく、核型特異的に活性のあることがわかった。//　(2)次にPPIase活性がヒストンシャペロン活性に必要かどうかを検討した。PPIase活性の阻害剤であるFK506を用いて、ヒストンシャペロン活性が阻害されるかどうかを検討したところ、FK506はヒストンシャペロン活性を阻害しないことが判明した。したがって、PPIase活性はヒストンシャペロン活性に効果を及ぼさないと考えられる。//　(3)上記2種類の実験から、N末側領域の非PPIaseドメインのみでヒストンシャペロン活性を発揮することが予想された。そこで核型FKBPの欠失変異体を作成し、N末側領域だけでヒストンシャベロン活性を示すかどうかを検討したところ、核型特異的なN末側領域がヒストンシャペロン活性には必要十分であることが判明した。以上3種類の実験から、核型FKBPはヒストンシャペロンドメインとPPIaseドメインの2つの独立したドメインからなる蛋白質であることがわかった。//III.核型FKBPのrDNAサイレンシング反応への関与//1.核型FKBPとrDNAサイレンシング反応//　生体内での核型FKBPのクロマチン関連反応における役割を検討した。先ず、核型FKBPの細胞内局在性を再検討したところ核小体に濃縮されていることがわかった。さらにクロマチンIP法により、核型FKBPはrDNA領域に局在していることが見出された。出芽酵母細胞においては、rDNA領域においては、ヘテロクロマチン様の構造体が形成され、遺伝子発現がサイレンシングを受けていることがわかっている。これらの知見とヒストンシャペロンといった生化学的活性の知見から、核型FKBPはrDNAサイレンシング反応に関与するのではないかと考えた。そこで、核型FKBPの欠失変異体からなる酵母細胞株を作成し、rDNAサイレンシング反応活性を検討したところ、核型FKBPの欠失によりrDNAサイレンシング反応活性が解除されることがわかった。この結果は、核型FKBPがrDNAサイレンシング反応に関与していることを意味している。//2.ヒストンシャペロンドメインとrDNAサレンシング反応//　次に核型FKBPのどの領域がrDNAサイレンシング反応に関与するかを解析した。核型FKBPの欠失変異体酵母細胞において、全長あるいはヒストンシャペロンドメインの発現により、rDNAサイレンシング反応活性は回復を示したものの、PPIaseドメインでは活性の回復は見られなかった。したがってrDNAサイレンシング反応にはヒストンシャペロンドメインだけで十分であることが判明した。このことは、核型FKBPがヒストンシャペロン活性を通してrDNAサイレンシング反応に関わっていることを示唆している。//3.PPIaseドメインによるrDNAサイレンシング反応制御//　核型FKBPのPPIaseドメインはrDNAサイレンシング反応に必須ではないと判明したが、PPIase活性はrDNAサイレンシング反応にどのように関っているのか?PPIase活性中心部位にPPIase活性の低下する点変異を導入して、PPIase活性のrDNAサイレンシング反応への役割を検討したところ、PPIase活性の低下する点変異により、rDNAサイレンシング反応活性が増強されることが判明した。この知見から、PPIase活性はrDNAサイレンシング反応に必須ではないものの、その制御には働いていると予想できる。次に、核型FKBPの点変異体がヒストンシャペロン活性の制御に関わるか否かを検討したところ、この点変異はヒストンシャペロン活性には大きく影響を与えないことが判明した。したがってPPIase活性はヒストンシャペロン活性に効果をもたらすものではなく、他のタイプのクロマチン関連因子などとの相互作用を通してrDNAサイレンシング反応の制御に関与することが考えられた。//IV.今後、解析すべき課題//1.核型FKBPのDNA構造変換に対する作用//　従来のヒストンシャペロンは、前処理としてヒストンと結合させておくことによりヒストンシャペロン活性を発揮する。一方、核型FKBPのヒストンシャペロン活性を生み出すには、ヒストンとの前処理を必要としなかったため、核型FKBPにはピストン以外の標的があるのではないかと考えた。ヌクレオソームがヒストンとDNAにより構成されていることから、核型FKBPがDNAに対して作用すると考え、検討したところ、それに即した結果が得られている。今後核型FKBPのDNAへの作用活性機構を解析していく予定である。//2.PPIaseドメインの意義//　核型FKBPのPPIaseドメインに点変異を導入し、その反応活性を解析したところ、変異核型FKBPはrDNAサイレンシング反応活性を増強するものの、ヒストンシャペロン活性には効果を持たなかった。この結果から、PPIaseドメインがrDNAサイレンシングに関与する蛋白質を標的として働いていることが考えられる。PPIaseは、クロマチン構造変換因子と遺伝学的相互作用のあることが知られていることから、PPIaseドメインのクロマチン構造変換因子に対する制御活性によりサイレンシング反応の制御を行っていることも考えられる。//　FKBPと転写基本因子との相互作用を見出しており、転写基本因子TFIIDが転写活性化時に構造変換する可能性が既に示されていることから、PPIaseを介した転写基本因子群の構造変換は転写活性化機構の新しい局面を切り拓くのに寄与するかもしれない。また、転写調節因子の中には、高プロリン領域を転写活性化ドメインとして有するものが知られており、この高プロリン領域の構造変換を介して転写制御を行う可能性がある。//　PPIaseドメインとヒストンシャペロンドメイン双方とも構造変換活性を有することを考え合わせると、両ドメインを通して核型FKBPは効率よくクロマチン機能変換を行っていることが示唆される。//3.rDNAサイレンシング反応での役割(老化への関与の可能性)//　rDNAサイレンシングには、ヒストン脱アセチル化酵素などのクロマチン因子の関与することが知られていることから、核型FKBPとそれらの因子群との協調的または阻害的な作用を遺伝学的・生化学的に解析する。//　さらに、rDNAサイレンシング反応は細胞老化と密接に関係のあることが知られていることから、核型FKBPの働きは細胞老化に関与する可能性がある。細胞老化と関連することが既に知られているヘテロクロマチン因子との機能的相互作用を検討し、老化関連因子間の相互作用ネットワークを検討していく。また、細胞老化に伴ってrDNAが円形DNAとして染色体外に放出されることが知られており、これが核型FKBPのDNAへの作用活性と関連しているのかを検討する。報告番号: 乙16053 ; 学位授与年月日: 2004-07-14 ; 学位の種別: 論文博士 ; 学位の種類: 博士(薬学) ; 学位記番号: 第16053号 ; 研究科・専攻: 薬学系研究

NMR spectra of PB2 627, the RNA-binding domain in influenza A virus RNA polymerase that contains the pathogenicity factor lysine 627, and improvement of the spectra by small osmolytes

The influenza A virus, which has an RNA genome, requires RNA-dependent RNA polymerase for transcription and replication. The polymerase is comprised of the subunits PA, PB1, and PB2. The C-terminal RNA-binding domain in PB2 contains lysine 627 (PB2 627), which is associated with pathogenicity and host range. However, the structure and molecular mechanism of PB2 627 in solution remain obscure. Here, we investigated PB2 627 in solution by nuclear magnetic resonance (NMR) and detected inhomogeneity in the intensities of backbone amide proton signals due to local fluctuations in structure. To characterize the effects of chemical chaperones on spectral data and improve the data quality, we tested 20 different additives, including L-arginine L-glutamate salt, (L-arginine)2SO4, glycerol, β-octylglucoside, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate, Na2SO4, 1,5-diaminopentane, 1,4-diaminobutane, trehalose, sucrose, glycine, trimethylamine N-oxide, β-alanine, L-α-alanine, hydroxyectoine, betaine, L-proline, and non-detergent sulfobetaine 195, 201, and 256. We evaluated the quality of the resulting spectra by calculating the standard deviation and average of the ratio of signal intensities to noise level of amide peaks, as well as the ratio of the standard deviation to the average. NMR-profile analysis revealed diverse effects of additives on the dynamic properties of PB2 627. Based on such criteria, we found that small osmolytes such as glycine and L-α-alanine reduced structural fluctuations and improved the quality of spectral data, which is likely to facilitate a detailed NMR-based structural analysis. The methodology developed here may also be more generally useful for evaluating the effects of chemical chaperones on the structural integrity of proteins

Enantiomer-selective Anti-influenza Activity of Bakuchiol

Background: Novel therapeutic approaches against influenza are required. Bakuchiol is a phenolic isoprenoid found in Babchi seeds. Results: Bakuchiol enantiomer-selectively inhibited influenza A viral infection and growth and activated the Nrf2 pathway. Conclusion: Bakuchiol showed novel enantiomer-selective anti-influenza viral activity. Significance: The study of bakuchiol will contribute to the development of novel approaches to influenza therapy

Anti-influenza virus activity of extracts from the stems of Jatropha multifida Linn. collected in Myanmar

Background: To contribute to the development of novel anti-influenza drugs, we investigated the anti-influenza activity of crude extracts from 118 medicinal plants collected in Myanmar. We discovered that extract from the stems of Jatropha multifida Linn. showed anti-influenza activity. J. multifida has been used in traditional medicine for the treatment of various diseases, and the stem has been reported to possess antimicrobial, antimalarial, and antitumor activities. However, the anti-influenza activity of this extract has not yet been investigated. Methods: We prepared water (H2O), ethyl acetate (EtOAc), n-hexane (Hex), and chloroform (CHCl3) extracts from the stems of J. multifida collected in Myanmar, and examined the survival of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells infected with the influenza A (H1N1) virus, and the inhibitory effects of these crude extracts on influenza A viral infection and growth in MDCK cells. Results: The H2O extracts from the stems of J. multifida promoted the survival of MDCK cells infected with the influenza A H1N1 virus. The EtOAc and CHCl3 extracts resulted in similar, but weaker, effects. The H2O, EtOAc, and CHCl3 extracts from the stems of J. multifida inhibited influenza A virus H1N1 infection; the H2O extract possessed the strongest inhibitory effect on influenza infection in MDCK cells. The EtOAc, Hex, and CHCl3 extracts all inhibited the growth of influenza A H1N1 virus, and the CHCl3 extract demonstrated the strongest activity in MDCK cells. Conclusion: The H2O or CHCl3 extracts from the stems of J. multifida collected in Myanmar demonstrated the strongest inhibition of influenza A H1N1 viral infection or growth in MDCK cells, respectively. These results indicated that the stems of J. multifida could be regarded as an anti-influenza herbal medicine as well as a potential crude drug source for the development of anti-influenza compounds

Jiadifenolide induces the expression of cellular communication network factor (CCN) genes, and CCN2 exhibits neurotrophic activity in neuronal precursor cells derived from human induced pluripotent stem cells

Jiadifenolide has been reported to have neurotrophin-like activity in primary rat cortical neurons, and also possesses neurotrophic effects in neuronal precursor cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), as we have previously reported. However, the molecular mechanisms by which jiadifenolide exerts its neurotrophic effects in rat and human neurons are unknown. Thus, we aimed to investigate the molecular mechanisms and pathways by which jiadifenolide promotes neurotrophic effects. Here, we found that jiadifenolide activated cellular communication network factor (CCN) signaling pathways by up-regulating mRNA level expression of CCN genes in human neuronal cells. We also found that CCN2 (also known as connective tissue growth factor, CTGF) protein promotes neurotrophic effects through activation of the p44/42 mitogen-activated protein kinase signaling pathway. This is the first discovery which links neurotrophic activity with CCN signaling

Evidence for Spin–Orbit Alignment in the TRAPPIST-1 System

In an effort to measure the Rossiter–McLaughlin effect for the TRAPPIST-1 system, we performed high-resolution spectroscopy during transits of planets e, f, and b. The spectra were obtained with the InfraRed Doppler spectrograph on the Subaru 8.2 m telescope, and were supplemented with simultaneous photometry obtained with a 1 m telescope of the Las Cumbres Observatory Global Telescope. By analyzing the anomalous radial velocities, we found the projected stellar obliquity to be λ = 1 ± 28° under the assumption that the three planets have coplanar orbits, although we caution that the radial-velocity data show correlated noise of unknown origin. We also sought evidence for the expected deformations of the stellar absorption lines, and thereby detected the "Doppler shadow" of planet b with a false-alarm probability of 1.7%. The joint analysis of the observed residual cross-correlation map including the three transits gave λ = 19_(-15)^(+13)°. These results indicate that the the TRAPPIST-1 star is not strongly misaligned with the common orbital plane of the planets, although further observations are encouraged to verify this conclusion

Planet(esimal)s Around Stars with TESS (PAST) III: A Search for Triplet He I in the Atmospheres of Two 200 Myr-old Planets

We report a search for excess absorption in the 1083.2 nm line of ortho (triplet) helium during transits of TOI-1807b and TOI-2076b, 1.25 and 2.5R$_{\rm Earth}$ planets on 0.55- and 10.4-day orbits around nearby $\sim$200~Myr-old K dwarf stars. We limit the equivalent width of any transit-associated absorption to $<$4 and $<$8 mA, respectively. We limit the escape of solar-composition atmospheres from TOI-1807b and TOI-2076b to $\lesssim$1 and $\lesssim$0.1M$_{\rm Earth}$ Gyr$^{-1}$, respectively, depending on wind temperature. The absence of a H/He signature for TOI-1807b is consistent with a measurement of mass indicating a rocky body and the prediction by a hydrodynamic model that any H-dominated atmosphere would be unstable and already have been lost. Differential spectra obtained during the transit of TOI-2076b contain a He I-like feature, but this closely resembles the stellar line and extends beyond the transit interval. Until additional transits are observed, we suspect this to be the result of variation in the stellar He I line produced by rotation of active regions and/or flaring on the young, active host star. Non-detection of escape could mean that TOI-2076b is more massive than expected, the star is less EUV-luminous, the models overestimate escape, or the planet has a H/He-poor atmosphere that is primarily molecules such as H$_2$O. Photochemical models of planetary winds predict a semi-major axis at which triplet He I observations are most sensitive to mass loss: TOI-2076b orbits near this optimum. Future surveys could use a distance criterion to increase the yield of detections.Comment: Accepted to MNRA

Limits on the Spin-Orbit Angle and Atmospheric Escape for the 22 Myr-old Planet AU Mic b

We obtained spectra of the pre-main sequence star AU Microscopii during a transit of its Neptune-sized planet to investigate its orbit and atmosphere. We used the high-dispersion near-infrared spectrograph IRD on the Subaru telescope to detect the Doppler "shadow" from the planet and constrain the projected stellar obliquity. Modeling of the observed planetary Doppler shadow suggests a spin-orbit alignment of the system ($\lambda=-4.7_{-6.4}^{+6.8}$ degrees), but additional observations are needed to confirm this finding. We use both the IRD data and spectra obtained with NIRSPEC on Keck-II to search for absorption in the 1083 nm line of metastable triplet He I by the planet's atmosphere and place an upper limit for the equivalent width of 3.7 m\AA at 99 $\%$ confidence. With this limit and a Parker wind model we constrain the escape rate from the atmosphere to $<0.15-0.45\, M_{\oplus}$ Gyr$^{-1}$, comparable to the rates predicted by an XUV energy-limited escape calculation and hydrodynamic models, but refinement of the planet mass is needed for rigorous tests.Comment: 10 pages, 5 figures, accepted for publication in ApJ Letter