Spatial transcriptomics reveals altered lipid metabolism and inflammation-related gene expression of sebaceous glands in psoriasis and atopic dermatitis

Sebaceous glands drive acne, however, their role in other inflammatory skin diseases remains unclear. To shed light on their potential contribution to disease development, we investigated the spatial transcriptome of sebaceous glands in psoriasis and atopic dermatitis patients across lesional and non-lesional human skin samples. Both atopic dermatitis and psoriasis sebaceous glands expressed genes encoding key proteins for lipid metabolism and transport such as ALOX15B, APOC1, FABP7, FADS1/2, FASN, PPARG, and RARRES1. Also, inflammation-related SAA1 was identified as a common spatially variable gene. In atopic dermatitis, genes mainly related to lipid metabolism (e.g. ACAD8, FADS6, or EBP) as well as disease-specific genes, i.e., Th2 inflammation-related lipid-regulating HSD3B1 were differentially expressed. On the contrary, in psoriasis, more inflammation-related spatially variable genes (e.g. SERPINF1, FKBP5, IFIT1/3, DDX58) were identified. Other psoriasis-specific enriched pathways included lipid metabolism (e.g. ACOT4, S1PR3), keratinization (e.g. LCE5A, KRT5/7/16), neutrophil degranulation, and antimicrobial peptides (e.g. LTF, DEFB4A, S100A7-9). In conclusion, our results show that sebaceous glands contribute to skin homeostasis with a cell type-specific lipid metabolism, which is influenced by the inflammatory microenvironment. These findings further support that sebaceous glands are not bystanders in inflammatory skin diseases, but can actively and differentially modulate inflammation in a disease-specific manner

The transcription factor IRF8 regulates Th1 and Treg differentiation

Inhaltsverzeichnis DANKSAGUNG III ZUSAMMENFASSUNG V ABSTRACT VII INHALTSVERZEICHNIS IX 1\. EINLEITUNG 1 1.1 DATENINTEGRATION 1 1.2 GRUNDLAGEN DES IMMUNSYSTEMS 2 1.2.1 ANGEBORENE IMMUNANTWORT 2 1.2.2 ADAPTIVE IMMUNANTWORT 3 1.3 GRUNDLAGEN DER T-ZELLIMMUNOLOGIE 3 1.3.1 ZENTRALE UND PERIPHERE TOLERANZ 4 1.3.2 AKTIVIERUNG VON T-HELFERZELLEN 4 1.3.2.1 T-Zell-Rezeptor Signalkaskade 5 1.3.2.2 Der Co-Stimulator CD28 7 1.3.2.3 Unphysiologische Stimulation von T-Zellen mit PMA und Ionomycin 7 1.3.2.4 Inhibition der T-Zell-Rezeptor Signalkaskade 8 1.3.3 FUNKTION UND DIFFERENZIERUNG VON T-HELFERZELLEN IN DER PERIPHERIE 8 1.3.3.1 Th1 Zellen 9 1.3.3.2 Th2 Zellen 10 1.3.3.3 Th17 Zellen 11 1.3.3.4 Treg Zellen 12 1.4 IRF8 13 1.5 ZIELSTELLUNG 14 2\. ERGEBNISSE 15 2.1 TRANSKRIPTOM-ANALYSE VON T-HELFERZELL-POPULATIONEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SUBTYP-SPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 15 2.1.1 QUALITÄTSANALYSE DER POLARISIERTEN TH1, TH2 UND ITREG ZELLEN 15 2.1.2 IDENTIFIKATION VON SUBTYP- SPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IN DER DIFFERENZIERUNG VON T-HELFERZELLEN 18 2.1.3 VALIDIERUNG VON DIFFERENZIELL EXPRIMIERTEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 21 2.2 INTEGRATIVE NETZWERKANALYSE 22 2.2.1 STAT4-NETZWERK FÜR TH1 ZELLEN 23 2.2.2 STAT6-NETZWERK FÜR TH2 ZELLEN 26 2.2.3 VALIDIERUNG DES STAT4- UND DES STAT6-NETZWERKES 28 2.3 DIE ROLLE VON IRF8 IN DER PERIPHEREN T-ZELLAKTIVIERUNG UND DIFFERENZIERUNG 29 2.3.1 DIE EXPRESSION VON IRF8 IST VOM TCR ABHÄNGIG 29 2.3.1.1 Die Expression von Irf8 ist von der TCR-Stimulationszeit abhängig 29 2.3.1.2 Die Expression von Irf8 ist von der Stärke des TCR-Stimulus abhängig 30 2.3.1.3 Die Induktion der Expression von Irf8 wird über den AP1-Signalweg vermittelt 31 2.3.2 IMMUNOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON IRF8 -/- MÄUSEN 32 2.3.2.1 Die Zellanzahl und Größe von Milz und Lymphknoten der Irf8 -/- Mäuse sind erhöht 33 2.3.2.2 IRF8-defiziente Mäuse zeigen eine veränderte Zusammensetzung von unterschiedlichen Immunzellen 33 2.3.2.3 Ein IRF8-Defizit begünstigt in vitro die Entstehung von TBET+ und FOXP3+ Zellen 35 2.3.2.4 Ein IRF8-Defizit begünstigt in vitro die Entstehung der Zytokine GM-CSF und IFNγ unter Th1 polarisierenden Bedingungen 37 2.3.2.5 Gedächtnis-T-Zellen von Irf8 -/- Mäusen zeigen eine veränderte Zytokinproduktion und eine verminderte Anzahl an TBET+ Zellen 40 2.3.2.6 Ein IRF8-Defizit führt zur Erhöhung der Proteinmenge der am TGFβ-Signalweg beteiligten Mediatoren TGFβR2 und SMAD2/3 43 2.3.2.7 IRF8 zeigt keinen Einfluss auf die T-Zellproliferation aber einen anti-apoptotischen Effekt in den Gedächtnis-T-Zellen und in der Differenzierung von Th1 und iTreg Zellen 44 2.3.3 DIE ADENOVIRALE ÜBEREXPRESSION UND DER SHRNA-KNOCKDOWN VON IRF8 VALIDIEREN DEN SUPPRESSIVEN EFFEKT VON IRF8 IN DER IN VITRO DIFFERENZIERUNG VON TH1 UND ITREG ZELLEN 47 2.3.3.1 Die adenovirale Transduktion, die Überexpression und der Knockdown von Irf8 sind effizient 47 2.3.3.2 Die Überexpression von Irf8 in naiven T-Zellen verringert die Anzahl an apoptotischen sowie TBET+, IFNγ+ und GM-CSF+ Zellen unter Th1 polarisierenden Bedingungen 48 2.3.3.3 Der shRNA-Knockdown von Irf8 in naiven T-Zellen erhöht die Anzahl an TBET+ und IFNγ+ Zellen unter Th1 polarisierenden Bedingungen 50 2.3.3.4 Die Überexpression von Irf8 in naiven T-Zellen verringert die Anzahl an FOXP3+ Zellen unter iTreg polarisierenden Bedingungen 50 3\. DISKUSSION 51 3.1 DIE INTEGRATIVE NETZWERKANALYSE IST EIN NÜTZLICHES WERKZEUG ZUR BESCHREIBUNG VON T-HELFERZELL- DIFFERENZIERUNGSPROZESSEN 51 3.1.1 DIE MEHRHEIT DER STAT6-REGULIERTEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN WIRD PRÄFERENZIELL IN TH2 ZELLEN EXPRIMIERT 51 3.1.2 DIE MEHRHEIT DER STAT6- BZW. STAT4-POSITIV-REGULIERTEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN SIND AKTIVATOREN FÜR DIE TH2- BZW. TH1 DIFFERENZIERUNG ODER REPRESSOREN FÜR DIE DIFFERENZIERUNG DER ANDEREN T-HELFERZELL-SUBTYPEN 53 3.1.3 DIE DIFFERENZIERUNG VON TH1 UND TH2 ZELLEN VERLÄUFT PLASTISCH UND WIRD AKTIV DURCH AKTIVATOREN GESTEUERT 55 3.1.4 STAT6- UND STAT4-REGULIERTE GENE SIND ASTHMA- UND RHEUMA-RISIKOGENEN ASSOZIIERT 55 3.1.5 DIE INTEGRATIVE NETZWERKANALYSE IDENTIFIZIERT BISHER UNBEKANNTE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN FÜR DIE DIFFERENZIERUNG VON TH1 UND TH2 ZELLEN 56 3.2 DIE TRANSKRIPTOM- UND INTEGRATIVEN NETZWERKANALYSEN IDENTIFIZIEREN IRF8 ALS POTENZIELLEN REGULATOR DER T-ZELLDIFFERENZIERUNG 58 3.2.1 DIE TRANSKRIPTOM-ANALYSE DER T-HELFERZELLEN IDENTIFIZIEREN FUNKTIONELL BEKANNTE UND UNBEKANNTE SUBTYP-SPEZIFISCHE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 58 3.2.2 DIE INTEGRATIVEN NETZWERKANALYSEN IDENTIFIZIERTEN IRF8 ALS POTENZIELLEN WEICHENSTELLER IN DER DIFFERENZIERUNG VON TH1 ZELLEN 59 3.3 IRF8 IST EIN REGULATOR DER T-ZELLDIFFERENZIERUNG 60 3.3.1 DIE INDUKTION DER EXPRESSION VON IRF8 WIRD ÜBER DEN TCR SOWIE DURCH SUBTYP-SPEZIFISCHE ZYTOKINE IN T-HELFERZELLEN INDUZIERT 60 3.3.2 IRF8 FÖRDERT IN VIVO DIE TH1 IMMUNANTWORT ÜBER DIE MODULATION DER FUNKTION VON APCS 63 3.3.3 IRF8 IST EIN REPRESSOR FÜR DIE IN VITRO DIFFERENZIERUNG VON TH1 ZELLEN 64 3.3.4 IRF8 IST EIN EXTRINSISCHER AKTIVATOR UND EIN INTRINSISCHER REPRESSOR FÜR DIE INDUKTION UND DIFFERENZIERUNG VON TREG ZELLEN 67 3.3.5 IRF8 KONTROLLIERT INTRINSISCH DIE TH1- UND ITREG- IMMUNANTWORT DURCH REGULATION DES FAS-VERMITTELTEN ZELLTODS 69 3.4 SCHLUSSFOLGERUNG 71 3.5 AUSBLICK 72 4\. MATERIALEN UND METHODEN 75 4.1 MATERIAL 75 4.1.1 DATENSÄTZE 75 4.1.2 MAUSSTÄMME UND HALTUNGSBEDINGUNGEN 75 4.1.3 PLASMIDE UND VEKTOREN 76 4.1.4 KOMPETENTE BAKTERIEN FÜR DIE KLONIERUNG VON PLASMIDEN 76 4.1.5 OLIGONUKLEOTIDE 76 4.1.6 ENZYME UND INHIBITOREN 77 4.1.7 ANTIKÖRPER UND ZYTOKINE 78 4.1.8 MAGNETISCHE BEADS FÜR DIE ZELLSEPARATION 79 4.1.9 KITS 79 4.1.10 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 80 4.1.11 GERÄTE 81 4.1.11 LÖSUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 81 4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITEN 82 4.2.1 DNA-AUFREINIGUNG 82 4.2.1.1 Mini- Präparation von Plasmiden mit einer Größe über 10 kB 82 4.2.2 RNA-AUFREINIGUNG 82 4.2.3 CDNA-SYNTHESE 83 4.2.4 REAL-TIME PCR (QRT-PCR) 83 4.2.5 RNA- SEQUENZIERUNG 83 4.2.6 SDS-POLYACRYLGELELEKTROPHORESE (PAGE) 84 4.2.7 WESTERN BLOT 84 4.2.8 GENOTYPISIERUNG DER IRF8 -/- MÄUSE 85 4.2.9 KLONIERUNG VON PLASMIDEN FÜR DEN ADENOVIRALEN GENTRANSFER 85 4.2.9.1 Klonierung des Transfervektors pACDC-Irf8 für die Überexpression von Irf8 85 4.2.9.2 Klonierung des Transfervektors pACDC-Irf8sh und pACDC-controlsh für den shRNA- Knockdown von Irf8 86 4.2.9.3 Klonierung von pAd-Konstrukten 88 4.3 ZELLKULTUR 88 4.3.1 ZELLLINIEN 88 4.3.2 HERSTELLUNG UND AMPLIFIKATION VON ADENOVIRALEN ÜBERSTÄNDEN 89 4.3.3 ISOLATION UND SORTIERUNG VON T-ZELLEN AUS DER MILZ UND DEN LYMPHKNOTEN 89 4.3.3.1 Sortierung von murinen CD4+CD25- T-Zellen durch magnetische Zellsortierung 90 4.3.3.2 Sortierung von murinen CD4+CD25-CD45RBhigh T-Zellen durch FACS 90 4.3.3.3 Sortierung von murinen naiven CD4+CD25-CD62L+CD44- und Gedächtnis-T-Zellen durch FACS 90 4.3.4 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL MITHILFE DER NEUBAUER ZÄHLKAMMER 90 4.3.5 KURZZEITSTIMULATION VON NAIVEN T-ZELLEN UND INHIBITION DES TCR-SIGNALWEGS 90 4.3.6 BESTIMMUNG DES PROLIFERATIONSVERHALTENS MITTELS EINER CFSE-FÄRBUNG 91 4.3.7 ADENOVIRALE TRANSDUKTION VON NAIVEN T-ZELLEN 91 4.3.8 IN VITRO DIFFERENZIERUNG VON T-HELFERZELLEN 91 4.3.9 FICOLLISIERUNG VON IN VITRO DIFFERENZIERTEN T-ZELLEN 92 4.3.10 APOPTOSE-INDUKTION IN NAIVEN UND IN IN VITRO DIFFERENZIERTEN T-ZELLEN 92 4.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 92 4.4.1 FÄRBUNG VON OBERFLÄCHENMARKERN 93 4.4.2 FÄRBUNG VON APOPTOTISCHEN ZELLEN 93 4.4.3 FÄRBUNG VON TOTEN ZELLEN 93 4.4.4 INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 93 4.4.5 INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG VON ZYTOKINEN 93 4.5 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 94 4.5.1 PROZESSIERUNG DER RNA-SEQ DATEN DER T-HELFERZELLEN 94 4.5.2 IDENTIFIKATION VON SUBTYP-SPEZIFISCHEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN: KONSTRUKTION EINER HEADMAP UND KINETISCHES CLUSTERING 94 4.5.3 PROZESSIERUNG UND ANALYSE VON ÖFFENTLICH VERFÜGBAREN DATEN FÜR DIE KONSTRUKTION VON GENREGULATORISCHEN NETZWERKEN 95 4.5.4 TEXTMINIG RECHERCHE ZUR BESTIMMUNG VON POTENZIELLEN TH1-SPEZIFISCH-EN GEN-GEN-INTERAKTIONEN 96 4.5.5 KONSTRUKTION DER GENREGULATORISCHEN NETZWERKE 96 4.5.6 LITERATURRECHERCHE ZU DEN STAT4- UND STAT6-GEBUNDENEN UND REGULIERTEN GENEN 97 4.5.7 PRÄFERENZIELLE GENEXPRESSION DER STAT4- UND STAT6-REGULIERTEN GENE 97 4.5.8 ANALYSE ZU DEN ASTHMA- UND RA- ASSOZIIERTEN RISIKOGENEN UNTER DEN STAT4- UND STAT6-REGULIERTEN GENEN 97 4.5.9 IN SILICO ANALYSE ZUR IDENTIFIKATION VON POTENZIELLEN TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDESTELLEN IM PROMOTOR VON IRF8 98 4.5.10 KONSTRUKTION EINES 3D-PLOTS AUS DURCHFLUSSZYTOMETRISCHEN DATEN 98 ANHANG XV LITERATUR XXIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS XXXIX PUBLIKATIONEN XLIII LEBENSLAUF XLV EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG XLVIIDatenintegration in Form von integrativen Netzwerkanalysen wurde in den letzten Jahren erfolgreich für die Beschreibung von neuen molekularbiologischen Zusammenhängen in biologischen Netzwerken eingesetzt. In dieser Arbeit diente die integrative Netzwerkanalyse als nützliches Werkzeug für die Beschreibung der Differenzierungsprozesse von T-Helfer (Th) -zellen. Diese spielen eine wichtige Rolle in der adaptiven Immunantwort, sowie in der Pathogenese von chronisch infektiösen, allergischen und autoimmunen Erkrankungen. Die Identifikation von potenziell richtungsweisenden Transkriptionsfaktoren in der Differenzierung von T-Helferzellen war ein vorrangiges Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden zunächst globale Transkriptom- Analysen von T-Helferzellen vorgenommen und Subtyp-spezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren identifiziert. Hierzu zählen u. a. Irf8 und Etv6 in Th1, Npas2 und Asb2 in Th2 sowie Irf8 und Dbp in induzierten regulatorischen T (iTreg) -Zellen. Zur Unterstützung der Auswahl an potenziellen Transkriptionsfaktoren wurde im zweiten Schritt eine integrative Netzwerkanalyse durchgeführt. Hierfür wurden verfügbare globale RNA-Seq Daten von Stat4 bzw. Stat6 Knockout Mausstudien sowie STAT4 bzw. STAT6 ChIP-Seq Daten mit dem generierten RNA-Seq Datensatz der T-Helferzellen integriert. Diese integrierten Daten wurden darüber hinaus in einem transkriptionellen Netzwerk um den Transkriptionsfaktor STAT4 für Th1 bzw. STAT6 für Th2 Zellen visualisiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Vorgehen der Datenintegration ein nützliches Werkzeug zur Beschreibung von Differenzierungsprozessen in T-Helferzellen ist. Des Weiteren validierte die integrative Netzwerkanalyse IRF8 als potenziellen Weichensteller in der Th1 Differenzierung. So wurde gezeigt, dass STAT4 und STAT6 direkt an das Gen von Irf8 binden und dessen Expression beeinflussen. Während STAT4 die Expression von Irf8 induziert, wird sie durch STAT6 supprimiert. Zusätzlich wurde in den Th1 Zellen eine potenzielle Gen-Gen-Interaktion von Irf8 mit dem Th1-spezifischen Zytokin Ifng gefunden. Die funktionelle Charakterisierung von IRF8 in der Differenzierung von T-Helferzellen war ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von Irf8 durch den T-Zellrezeptor Signalweg induziert und vermutlich Subtyp-spezifisch in Th1 und iTreg Zellen über die IFNγ/STAT1-, IL12/STAT4-, TGFβ/SMAD3- und IL2/STAT5-Signalwege verstärkt wird. Des Weiteren wiesen Irf8 -/- Mäuse eine verringerte Frequenz an Th1-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen (TBET+IFNγ+) und natürlichen regulatorischen T (nTreg) -Zellen auf. In vitro hingegen begünstigte ein IRF8-Defizit die Entstehung von TBET-, IFNγ- und GM-CSF-produzierenden Th1 sowie FOXP3-produzierenden iTreg Zellen. Zusätzlich führte ein IRF8-Defizit in polarisierten iTreg Zellen zur Erhöhung der Pro-teinmenge der am TGFβ- Signalweg beteiligten Mediatoren TGFβR2 und SMAD2/3. Die in vitro Beobachtungen in den IRF8-defizienten Zellen wurden mit adenoviraler Überexpression und shRNA-Knockdown von Irf8 validiert. Anhand dieser und publizierter Ergebnisse wurde erörtert, dass IRF8 als extrinsischer Aktivator über die Modulation der Funktion von APCs agiert und die Th1- sowie Treg- Immunantwort fördert. Intrinsisch hingegen wirkt IRF8 als Gegenspieler und kontrolliert die Immunantwort der Th1 Zellen über die TBET Proteinmenge, sowie die der iTreg Zellen über den TGFβ-Signalweg. Somit ist IRF8 in den T-Zellen für eine moderate IFNγ- sowie FOXP3-Produktion essentiell und verhindert eine überschießende Immunantwort. Die Ergebnisse in dieser Arbeit belegen, dass IRF8 ein wichtiger Regulator der T-Zelldifferenzierung ist und als potenzielles Zielgen in der Entwick-lung von neuen Therapieansätzen für T -Zell-spezifische Erkrankungen fungieren könnte.Within the past years data integration in terms of integrative network analysis was successfully used to describe new interrelations within biological networks on a molecular level. In this thesis the integrative network analysis was used as a tool to describe T helper (Th) cell fate decisions. T helper cells play a major role in the adaptive immune response as well as in the pathogenesis of chronic infectious, allergic and autoimmune diseases. The identification of important regulatory hubs in T helper cell fate decisions was a primary goal of this thesis. To identify subtype- specifically expressed transcription factors a global gene expression analysis of T helper cells was conducted. Among these are Irf8 and Etv6 in Th1, Npas2 and Asb2 in Th2 as well as Irf8 and Dbp in induced regulatory T (iTreg) cells. To support this selection of potential transcription factors as a second step an integrative network analysis was conducted. Therefore available global RNA- seq data of Stat4 and Stat6 knockout mice studies as well as STAT4 and STAT6 ChIP-seq data was integrated with the generated RNA-seq data set of T helper cells. In addition these integrated data were visualized in a gene regulatory network around the transcription factor STAT4 for Th1 and STAT6 for Th2 cells. It was shown that this approach of data integration is a useful tool for describing differentiation processes of T helper cells. Further the integrative network analysis validated IRF8 as a potential regulatory hub in Th1 cell differentiation. Thus it was shown that STAT4 and STAT6 directly bind to the gene of Irf8 and influence its expression. While STAT4 induces the expression of Irf8, STAT6 suppresses the expression of Irf8. Also a potential gene-gene interaction of Irf8 and the Th1 specific cytokine Ifng was found in Th1 cells. The functional characterization of IRF8 in T helper cell differentiation was a further goal of this thesis. It was shown that the expression of Irf8 is induced by the T cell receptor signaling and presumably subtype-specifically enhanced by IFNγ/STAT1-, IL12/STAT4-, TGFβ/SMAD3- and IL2/STAT5-signaling in Th1 and Treg cells. Moreover Irf8 -/- mice showed a decreased frequency in Th1 specific memory T cells (TBET+IFNγ+) and natural regulatory T (nTreg) cells. In vitro on the other hand an IRF8 deficit promoted the occurrence of TBET-, IFNγ- and GM-CSF-producing Th1 cells as well as FOXP3-producing iTreg cells. Further an IRF8 deficit in polarized iTreg cells resulted in an increased protein level of TGFβR2 and SMAD2/3 which serve as mediators in the TGFβ signaling pathway. These in vitro observations in IRF8 deficient cells were validated by adenoviral overexpression and shRNA knockdown of Irf8. Based on these and previously published results IRF8 was discussed as an extrinsic activator that promotes the Th1 and Treg immune response by modulating the function of APCs. Intrinsic IRF8 acts as an antagonist and controls the Th1 immune response by decreasing the TBET protein level as well as the Treg immune response by suppressing the TGFβ signaling pathway. Therefore IRF8 is essential for a moderate IFNγ and FOXP3 production in T cells and prevents an excessive immune response. The results of this thesis prove that IRF8 acts as a potential regulator in T helper cell differentiation. Thus IRF8 can serves as a potential target in the development of novel therapeutic approaches for T cell specific diseases

Characterization of High and Low IFNG-Expressing Subgroups in Atopic Dermatitis

Atopic dermatitis (AD) is one of the most common chronic inflammatory skin diseases, with an increasing number of targeted therapies available. While biologics to treat AD exclusively target the key cytokines of type 2 immunity, Janus kinase inhibitors target a broad variety of cytokines, including IFN-γ. To better stratify patients for optimal treatment outcomes, the identification and characterization of subgroups, especially with regard to their IFNG expression, is of great relevance, as the role of IFNG in AD has not yet been fully clarified. This study aims to define AD subgroups based on their lesional IFNG expression and to characterize them based on their gene expression, T cell secretome and clinical attributes. RNA from the lesional and non-lesional biopsies of 48 AD patients was analyzed by RNA sequencing. Based on IFNG gene expression and the release of IFN-γ by lesional T cells, this cohort was categorized into three IFNG groups (high, medium, and low) using unsupervised clustering. The low IFNG group showed features of extrinsic AD with a higher prevalence of atopic comorbidities and impaired epidermal lipid synthesis. In contrast, patients in the high IFNG group had a higher average age and an activation of additional pro-inflammatory pathways. On the cellular level, higher amounts of M1 macrophages and natural killer cell signaling were detected in the high IFNG group compared to the low IFNG group by a deconvolution algorithm. However, both groups shared a common dupilumab response gene signature, indicating that type 2 immunity is the dominant immune shift in both subgroups. In summary, high and low IFNG subgroups correspond to intrinsic and extrinsic AD classifications and might be considered in the future for evaluating therapeutic efficacy or non-responders

Toll-like receptor 7/8 agonists stimulate plasmacytoid dendritic cells to initiate TH17-deviated acute contact dermatitis in human subjects

BACKGROUND: A standardized human model to study early pathogenic events in patients with psoriasis is missing. Activation of Toll-like receptor 7/8 by means of topical application of imiquimod is the most commonly used mouse model of psoriasis. OBJECTIVE: We sought to investigate the potential of a human imiquimod patch test model to resemble human psoriasis. METHODS: Imiquimod (Aldara 5% cream; 3M Pharmaceuticals, St Paul, Minn) was applied twice a week to the backs of volunteers (n = 18), and development of skin lesions was monitored over a period of 4 weeks. Consecutive biopsy specimens were taken for whole-genome expression analysis, histology, and T-cell isolation. Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) were isolated from whole blood, stimulated with Toll-like receptor 7 agonist, and analyzed by means of extracellular flux analysis and real-time PCR. RESULTS: We demonstrate that imiquimod induces a monomorphic and self-limited inflammatory response in healthy subjects, as well as patients with psoriasis or eczema. The clinical and histologic phenotype, as well as the transcriptome, of imiquimod-induced inflammation in human skin resembles acute contact dermatitis rather than psoriasis. Nevertheless, the imiquimod model mimics the hallmarks of psoriasis. In contrast to classical contact dermatitis, in which myeloid dendritic cells sense haptens, pDCs are primary sensors of imiquimod. They respond with production of proinflammatory and T17-skewing cytokines, resulting in a T17 immune response with IL-23 as a key driver. In a proof-of-concept setting systemic treatment with ustekinumab diminished imiquimod-induced inflammation. CONCLUSION: In human subjects imiquimod induces contact dermatitis with the distinctive feature that pDCs are the primary sensors, leading to an IL-23/T17 deviation. Despite these shortcomings, the human imiquimod model might be useful to investigate early pathogenic events and prove molecular concepts in patients with psoriasis

Darier’s disease exhibits a unique cutaneous microbial dysbiosis associated with inflammation and body malodour

Abstract Background Darier’s disease (DD) is a genodermatosis caused by mutations of the ATP2A2 gene leading to disrupted keratinocyte adhesion. Recurrent episodes of skin inflammation and infections with a typical malodour in DD indicate a role for microbial dysbiosis. Here, for the first time, we investigated the DD skin microbiome using a metabarcoding approach of 115 skin swabs from 14 patients and 14 healthy volunteers. Furthermore, we analyzed its changes in the context of DD malodour and the cutaneous DD transcriptome. Results We identified a disease-specific cutaneous microbiome with a loss of microbial diversity and of potentially beneficial commensals. Expansion of inflammation-associated microbes such as Staphylococcus aureus and Staphylococcus warneri strongly correlated with disease severity. DD dysbiosis was further characterized by abundant species belonging to Corynebacteria, Staphylococci and Streptococci groups displaying strong associations with malodour intensity. Transcriptome analyses showed marked upregulation of epidermal repair, inflammatory and immune defence pathways reflecting epithelial and immune response mechanisms to DD dysbiotic microbiome. In contrast, barrier genes including claudin-4 and cadherin-4 were downregulated. Conclusions These findings allow a better understanding of Darier exacerbations, highlighting the role of cutaneous dysbiosis in DD inflammation and associated malodour. Our data also suggest potential biomarkers and targets of intervention for DD. Video Abstrac