Búsqueda de inhibidores frente a la proteína O-fucosiltransferasa 1 (PoFUT1)

La proteína O-fucosiltransferesa 1 (PoFUT1) es una fucosiltransferasa cuya función consiste en transferir un residuo fucosa a motivos tipo “epidermal growth factor like” (EGF) presentes en la proteína Notch. Esta modificación es esencial en el plegamiento de Notch y en la interacción con sus ligandos Delta y Serrate (Jagged en mamíferos). La vía de señalización de Notch está presente en numerosos procesos biológicos en eucariotas. Estudios recientes han demostrado que Notch aparece sobre-expresada en diversas enfermedades, como por ejemplo en algunos tipos de cáncer. Por tanto, la modificación post-traduccional producida por PoFUT1 es esencial para un correcto comportamiento de la proteína Notch y un correcto funcionamiento de la vía de señalización, lo que convierte a PoFUT1 en una diana terapéutica muy interesante. En nuestro grupo de investigación hemos descrito recientemente la estructura tridimensional de PoFUT1 de la especie Caenorhabditis elegans (CePOFUT1) en complejo con GDP-fucosa y GDP. La elección de esta especie como punto de partida resulta muy acertada, ya que es un enzima con una identidad del 100% con respecto a la humana a nivel de sitio activo, además de poder expresarse en grandes cantidades. En el presente trabajo se proponen cuatro compuestos como posibles inhibidores de la actividad fucosiltransferasa de CePOFUT1. Para ello se ha realizado un cribado de compuestos frente a la proteína utilizando la técnica de fluorescencia térmica. Además, se ha analizado el tipo de unión de los compuestos mediante técnicas de calorimetría, dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear y se han obtenido cristales mediante cocristalización de los cuatro compuestos con la proteína. Este trabajo resulta ser novedoso y con gran proyección al ser el punto de partida en la búsqueda de fármacos contra diferentes enfermedades, así como en el estudio del papel de la O-fucosilación en distintas etapas del desarrollo embrionario y en distintas condiciones fisiológicas

Bases moleculares y mecanismo de hidrólisis de mucinasas que dependen de clústeres de O-glicanos

Las mucinas son proteínas altamente O-glicosiladas que ejercen un gran número de funciones. Están localizadas en todas las mucosas del cuerpo y son el mayor componente proteíco en fluidos. Estas tienen en el intestino, entre otras funciones, la capacidad de defendernos de organismos patógenos así como de servir como hogar para la microbiota.Tanto las bacterias comensales como las bacterias patógenas que habitan el intestino grueso deben de degradar estas mucinas para poder alimentarse o para poder atravesar esta barrera de defensa llegando al epitelio para infectar al huésped. Para ello han desarrollado una batería de hidrolasas que degradan estas mucinas, entre ellas las mucinasas. Las mucinasas son O-glicoproteasas específicas de dominios tipo mucina altamente O-glicosilados. Se conocen muy pocas mucinasas hoy en día y todas ellas provienen de organismos procariotas.En este trabajo se presenta la caracterización basada en la obtención de estructuras cristalográficas, bases moleculares para el reconocimiento y mecanismos de hidrólisis entre otros resultados relacionados con las enzimas AM0627 y HC7.AM0627 es una de las pocas mucinasas conocidas hasta la fecha que es capaz de actuar entre dos O-glicanos contiguos mientras que HC7 pertenece a una nueva serie de mucinasas descubiertas recientemente, la cual es capaz de atacar clústeres de 3 y 4 O-glicanos. Además, mediante comparaciones estructurales del nuevo dominio de HC7, se han encontrado mucinasas pertenecientes a organismos eucariotas, lo que no se había conseguido hasta la fecha. Todos estos resultados nos han permitido ahondar en la degradación de este tipo de estructuras altamente O-glicosiladas llegando a definir las interacciones en detalle y describiendo los aminoácidos esenciales para su actividad. Gracias a esto se ha abierto un nuevo y amplio campo de investigación con nuevas mucinasas basadas en el plegamiento descubierto en esta tesis doctoral.<br /

Bases moleculares de la N-glicosilación en residuos de asparagina en eucariotas superiores y en residuos de arginina en enteropatógenos

La N-glicosilación es una modificación post-traduccional llevada a cabo por un gran número de enzimas cuyos sustratos son también muy variados. Nuestros estudios se han centrado en la N-glicosilación de residuos de arginina, ya que queríamos entender el mecanismo de acción de los efectores de Salmonella enterica y sus ortólogos de E.coli EPEC/EHEC y Citrobacter rodentium. En cuanto a la N-glicosilación de residuos de asparagina en eucariotas superiores, se ha centrado en la actividad de la enzima FUT8, ya que es la única enzima responsable de la fucosilación central en N-glicoproteínas de mamíferos y a pesar de muchos años de investigación sobre FUT8, su mecanismo de reacción permanecía desconocido y el requisito de un GlcNAc terminal en el brazo α (1,3) del N-glicano para una fucosilación óptima no se entendía bien.Con nuestro estudio, hemos podido elucidar las bases moleculares de la especificidad de sustrato que presentan la familia de enzimas NleB/SseK, y que recae en un único residuo, variable entre los efectores SseK y NleB, y localizado en la interfaz del complejo NleB/SseK-sustrato. La mutación de dicho residuo (Ser286SseK1 o Asn302SseK2 a TyrNleB/NleB1), confiere a dichos mutantes la capacidad de alcanzar parámetros cinéticos y termodinámicos óptimos. Además, con esta mutación conseguimos hacer activos a los mutantes S286YSseK1 y N302YSseK2 frente a sustratos que no lo son originalmente en la SseK1 y SseK2 salvajes (FADD para SseK1 y DR3 para SseK2). Gracias a esto, también se le confiere al patógeno Salmonella una mayor supervivencia y proliferación en la infección de macrófagos. Esto ocurre ya que este residuo que mutamos, confiere estabilidad a la interacción entre el residuo aceptor del sustrato (un residuo de arginina) con la base catalítica. En general, nuestro estudio proporciona las bases moleculares de las diferencias entre la especificidad de sustrato de los efectores NleB/SseK y ofrece pistas sobre la patogénesis molecular de los enteropatógenos.En cuanto a la enzima FUT8, hemos conseguido determinar la estructura cristalina de un complejo ternario que nos ha permitido concluir que la enzima sufre grandes cambios conformacionales en presencia de los ligandos GDP/GDP-Fucosa y el N-glicano. Lo especial de estos cambios conformacionales, se debe a que el movimiento inducido por GDP y probablemente GDP-Fucosa trae los residuos que son necesarios para el reconocimiento de GDP-Fucosa/GDP y en parte G0 al sitio de unión. En cuanto a las características del N-glicano, lo llamativo es la conformación anti-ψ que adopta la estructura de la quitobiosa, que es más inestable que la conformación syn-ψ encontrada en disolución. El sitio de reconocimiento de los brazos terminales del N-glicano es un exositio formado por los loops β10-β11 y el dominio SH3. Los dominios SH3 son dominios pequeños que no cumplen una función catalítica dentro de la proteína, y se pueden encontrar en numerosas proteínas multidominio cuyas funciones pueden ser muy variadas. Además, con nuestro trabajo demostramos por primera vez que el dominio SH3 de FUT8 interacciona con glicanos, lo cual no se había visto anteriormente y es un hallazgo que demuestra que estos dominios puedes ser versátiles y reconocer otras moléculas diferentes a proteínas. La desregulación de FUT8 se relaciona con un gran número de diferentes patologías. Con la aplicación de nuestro estudio multidisciplinar hemos encontrado dos potenciales mecanismos que están detrás de las preferencias de sustrato de FUT8. En el primero, los residuos de los brazos α (1,3)/α (1,6) determinan el reconocimiento de FUT8 en N-glicanos complejos o N-glicanos ricos o más pobres en manosas, siendo los primeros los preferidos por la enzima. El segundo modulador de la fucosilación está impulsado por la naturaleza de los residuos del entorno del sitio de N-glicosilación. FUT8 reconoce los aminoácidos subyacentes y, en particular, el sequon OST. Este reconocimiento probablemente no sea importante en el proceso general de fucosilación en N-glicanos complejos, pero por el contrario, encontramos que el reconocimiento de péptidos es clave para la fucosilación de N-glicanos ricos o más pobres en manosas. Además, las interacciones mediante enlaces de hidrógeno e hidrofóbicas junto con los residuos no interaccionantes de la proteína, podrían bloquear la unión de FUT8 a los N-glicanos, impidiendo la fucosilación incluido en N-glicanos complejos. <br /

Caracterización biofísica y estructural de C1GalT1 en la síntesis del core 1 de los O-glicanos de tipo mucina

La glicosilación es una de las modificaciones post-traduccionales más comunes en proteínas y es fundamental para muchas funciones biológicas, incluyendo la regulación de la estructura y correcto funcionamiento de las proteínas, así como la interacción proteína-proteína y célula-célula. C1GalT1 es una glicosiltransferasa de inversión que desempeña un papel crucial en la síntesis del core 1, la estructura precursora más común en la síntesis de los O-glicanos de tipo mucina, encontrados principalmente en proteínas de la superficie celular y proteínas secretadas.A pesar de la importancia de C1GalT1 en la glicosilación, la estructura de esta enzima y los detalles de su mecanismo de reconocimiento y catálisis de su sustrato no se conocen. Esta encima realiza la transferencia de una molécula de galactosa al antígeno Tn (molécula de GalNAc unido a un aminoácido de serina o treonina). En esta tesis se utilizaron técnicas biofísicas y celulares para resolver la estructura tridimensional y los mecanismos tanto de catálisis como de reconocimiento de C1GalT1. En concreto, se empleó cristalografía de rayos X para obtener la estructura de C1GalT1 en complejo con un glicopéptido, permitiendo obtener información detallada sobre el mecanismo de reconocimiento y catálisis del sustrato por parte de esta enzima.Gracias a estos hallazgos, pudo descubrirse que C1GalT1 se encuentra en solución en forma de homodímero y que presenta un tipo de plegamiento típico de las glicosiltransferasas de tipo A. Además, se pudo confirmar que sigue un mecanismo de reacción SN2. El estudio también reveló que la unión de los glicopéptidos a la enzima está principalmente impulsada por el grupo GalNAc, mientras que la secuencia del péptido proporciona una mejor optimización de los parámetros cinéticos y de unión. Además, se descubrió que, para lograr la glicosilación de todos sus sustratos, C1GalT1 reconoce una conformación de alta energía del enlace ¿-GalNAc-Thr, que apenas se encuentra en solución. Al imponer este estado tridimensional en ese residuo, característico de los péptidos ¿-GalNAc-Ser, C1GalT1 asegura la glicosilación de ambos sustratos aceptores.En general, estos hallazgos proporcionan una comprensión más detallada de la estructura y la función de C1GalT1 y sugieren un diseño estructural y mecanístico para explicar la glicosilación de múltiples sustratos aceptores. Estos descubrimientos también amplían el conocimiento de los mecanismos adoptados por las glicosiltransferasas para reconocer los diferentes sustratos, pudiendo tener implicaciones importantes para el desarrollo de nuevas terapias basadas en la modulación de la glicosilación.<br /

Recent advances in the design of Choline kinase α inhibitors and the molecular basis of their inhibition

Up-regulated choline metabolism, characterized by an increase in phosphocholine (PCho), is a hallmark of oncogenesis and tumor progression. Choline kinase (ChoK), the enzyme responsible for PCho synthesis, has consequently become of a promising drug target for cancer therapy and as such a significant number of ChoK inhibitors have been developed over the last few decades. More recently, due to the role of this enzyme in other pathologies, ChoK inhibitors have also been used in new therapeutic approaches against malaria and rheumatoid arthritis. Here, we review research results in the field of ChoKα inhibitors from their synthesis to the molecular basis of their binding mode. Strategies for the development of inhibitors and their selectivity on ChoKα over ChoKβ, the plasticity of the choline-binding site, the discovery of new exploitable binding sites, and the allosteric properties of this enzyme are highlighted. The outcomes summarized in this review will be a useful guide to develop new multi-functional potent drugs for the treatment of various human diseases

The essential role of water molecules in the reaction mechanism of protein O-Fucosyltransferase 2

Protein O-fucosyltransferase 2 (PoFUT2) is an inverting glycosyltransferase (GT) that fucosylates thrombospondin repeats (TSRs) from group 1 and 2. PoFUT2 recognizes a large and diverse number of TSRs through a dynamic network of water-mediated interactions. By X-ray structural studies of C. elegans PoFUT2 complexed to a TSR of group 2, we demonstrate that this GT recognizes similarly the 3D structure of TSRs from both groups 1 and 2. Its active site is highly exposed to the solvent, suggesting that water molecules might also play an essential role in the fucosylation mechanism. We applied QM/MM methods using human PoFUT2 as a model, and found that HsPoFUT2 follows a classical S(N)2 reaction mechanism in which water molecules contribute to a great extent in facilitating the release of the leaving pyrophosphate unit, causing the H transfer from the acceptor nucleophile (Thr/Ser) to the catalytic base, which is the last event in the reaction. This demonstrates the importance of water molecules not only in recognition of the ligands but also in catalysis

Production of a granulysin-based, tn-targeted cytolytic immunotoxin using pulsed electric field technology

Granulysin is a protein present in the granules of human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells, with cytolytic activity against microbes and tumors. Previous work demonstrated the therapeutic effect of the intratumoral injection of recombinant granulysin and of the systemic injection of an immunotoxin between granulysin and the anti-carcinoembryonic antigen single-chain Fv antibody fragment MFE23, which were produced in the yeast Pichia pastoris. In the present work, we developed a second immunotoxin combining granulysin and the anti-Tn antigen single-chain Fv antibody fragment SM3, that could have a broader application in tumor treatment than our previous immunotoxin. In addition, we optimized a method based on electroporation by pulsed electric field (PEF) to extract the remaining intracellular protein from yeast, augmenting the production and purificiation yield. The immunotoxin specifically recognized the Tn antigen on the cell surface. We also compared the thermal stability and the cytotoxic potential of the extracellular and intracellular immunotoxins on Tn-expressing human cell lines, showing that they were similar. Moreover, the bioactivity of both immunotoxins against several Tn+ cell lines was higher than that of granulysin alone

Estudio y purificación de los sustratos aceptores de la proteína O-fucosiltransferasa

La O-fucosilación es una modificación post-traduccional que tiene lugar generalmente en un gran número de proteínas de membrana o secretadas. Múltiples estudios han revelado que esta modificación está implicada en la señalización celular y plegamiento de proteínas durante el desarrollo embrionario, así como en el metabolismo del tejido adulto. Entre los diferentes elementos implicados en el proceso de O-fucosilación destacan las glicosiltransferasas (GTs) POFUT1 y POFUT2 las cuales transfieren residuos de fucosa desde GDP-fucosa a sustratos aceptores específicos. Mientras POFUT1 fucosila proteínas conteniendo repeticiones con estructura similar al factor de crecimiento epidermal (EGF). POFUT2 fucosila las repeticiones de tromboespondinas tipo 1 (TSRs). En ambas repeticiones se fucosilan residuos de serina o treonina y están formadas por tres puentes disulfuro. Si bien tanto la estructura cristalina de POFUT2 como la de los dominios TSR ha sido resuelta mediante la difracción por rayos X en múltiples estudios, sigue sin conocerse con precisión el mecanismo de transferencia de cómo la POFUT2 reconoce los TSRs y de por tanto como se fucosilan. En este sentido optimizaremos la expresión y purificación de diferentes dominios TSR para posteriormente caracterizar cualitativa y cuantitativamente la interacción entre estos y la enzima POFUT2. Además, algunos de estos dominios se utilizarán para obtener una estructura cristalina junto con la POFUT2 con el fin de elucidar el mecanismo de reacción de la fucosilación y se cómo esta GT reconoce a sus sustratos aceptores

Desarrollo de anticuerpos bi-específicos de unión a células NK (BiKE) frente al antígeno Tn para inmunoterapia en cáncer

Introduction and objective. BiKEs (bispecific killer cell engagers) are a new form of immunotherapy that consists of two connected scFv. One scFv recognizes a tumor antigen and the other binds to CD16 on the NK cell membrane, thus NK cells are activated and specifically target the tumor. It’s thought that BiKEs would have the advantage over monoclonal antibodies of more easily penetrating solid tumors and generating a stronger stimulus to NK cells that would be capable of activating them even in the immunosuppressive conditions of the tumor microenvironment. The objective of this work is to design and recombinantly express two BiKEs, in addition to three other proteins, using the Tn antigen as a target. This antigen is an aberrant glycosylation pattern specific to tumor cells and highly abundant in tumors of epithelial origin.Results. The 5 proteins have been expressed in HEK 293 6F cells with a good yield and degree of purity. We have been able to demonstrate that these proteins are correctly folded, dimerized and glycosylated. We also have probed that the scFvs of the BiKEs recognize Tn antigen as is described in the literature. However, the ability of BiKEs to activate NK cells against tumor cells in in vitro cultures couldn’t be demonstrated due to the lack of an adequate positive control.<br /

La granulisina como nueva terapia antitumoral

La granulisina (GRNLY) es una proteína producida por los linfocitos T citolíticos y células asesinas naturales. Tiene dos isoformas estables con peso molecular de 9 y 15 kDa. La granulisina recombinante de 9 kDa muestra actividad citolítica contra una variedad de microbios y también contra líneas celulares tumorales, debido a que induce la apoptosis celular. Los estudios realizados hasta la fecha sugieren que la granulisina es relevante para prevenir una variedad de infecciones humanas y, posiblemente, el cáncer. Hasta el momento, los estudios encaminados a utilizar la GRNLY como terapia anti-tumotal, se habían realizado con granulisina recombinante producida en bacterias, de la cual era difícil eliminar el lipopolisacárido bacteriano (LPS). En este trabajo se pretendía producir granulisina humana recombinante de 9kDa en P. pastoris, una levadura metilotrófica que es capaz de producir proteínas recombinantes con modificaciones postraduccionales solubles y correctamente plegadas, para evitar este problema. Para ello, el plásmido pPICZαC-GRNLY se linealizó con SalI y se transfectó mediante electroporación en P. pastoris. Se cultivaron las colonias transfectadas y se indujo con metanol la expresión de la granulisina recombinante. La proteína recombinante se purifico a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante columna de afinidad de níquel, ya que la proteína contenía una cola de histidinas. Se obtuvo un buen rendimiento de purificación. Seguidamente, la bioactividad de esta preparación de granulisina se ensayó sobre la línea celular Jurkat, demostrándose que la granulisina recombinante producida en P. pastoris induce muerte celular dependiente de la dosis. Estos resultados aseguran la futura producción de granulisina recombinante usando este sistema para poder continuar los ensayos in vivo previos a su posible utilización futura en la clínica