Analysis of microtubule movement on isolated Xenopus egg cortices provides evidence that the cortical rotation involves dynein as well as Kinesin Related Proteins and is regulated by local microtubule polymerisation

AbstractIn amphibians, the cortical rotation, a translocation of the egg cortex relative to the cytoplasm, specifies the dorsoventral axis. The cortical rotation involves an array of subcortical microtubules whose alignment is mediated by Kinesin–related proteins (KRPs), and stops as M-phase promoting factor (MPF) activation propagates across the egg. To dissect the role of different motor proteins in the cortical rotation and to analyse their regulation, we have developed an open cell assay system involving reactivation of microtubule movement on isolated cortices. Microtubule movements were dependent on ATP and consisted mainly of wriggling and flailing without net displacement, consistent with a tethering of microtubules to the cortex. Reactivated movements were inhibited by anti-KRP and anti-dynein antibodies perfused together but not separately, the KRP antibody alone becoming fixed to the cortex. Neither antibody could inhibit movement in the presence of MPF, indicating that arrest of the cortical rotation is not due to MPF-dependent inhibition of motor molecules. In contrast, D2O treatment of live eggs to protect microtubules from progressive depolymerisation prolonged the cortical rotation. We conclude that the cortical rotation probably involves cytoplasmic dynein as well as cortical KRPs and terminates as a result of local MPF-dependent microtubule depolymerisation

WNT/β-Catenin Signalling and Epithelial Patterning in the Homoscleromorph Sponge Oscarella

Sponges branch basally in the metazoan phylogenetic tree and are thus well positioned to provide insights into the evolution of mechanisms controlling animal development, likely to remain active in adult sponges. Of the four sponge clades, the Homoscleromorpha are of particular interest as they alone show the “true” epithelial organization seen in other metazoan phyla (the Eumetazoa). We have examined the deployment in sponges of Wnt signalling pathway components, since this pathway is an important regulator of many developmental patterning processes. We identified a reduced repertoire of three divergent Wnt ligand genes in the recently-sequenced Amphimedon queenslandica (demosponge) genome and two Wnts from our EST collection from the homoscleromorph Oscarella lobularis, along with well-conserved genes for intracellular pathway components (β-catenin, GSK3β). Remarkably, the two O. lobularis Wnt genes showed complementary expression patterns in relation to the evenly spaced ostia (canal openings) of the exopinacoderm (ectoderm), highly reminiscent of Wnt expression during skin appendage formation in vertebrates. Furthermore, experimental activation of the Wnt/β-catenin pathway using GSK3β inhibitors provoked formation of ectopic ostia, as has been shown for epithelial appendages in Eumetazoa. We thus suggest that deployment of Wnt signalling is a common and perhaps ancient feature of metazoan epithelial patterning and morphogenesis

An improved whole life cycle culture protocol for the hydrozoan genetic model Clytia hemisphaerica

The jellyfish species Clytia hemisphaerica (Cnidaria, Hydrozoa) has emerged as a new experimental model animal in the last decade. Favorable characteristics include a fully transparent body suitable for microscopy, daily gamete production and a relatively short life cycle. Furthermore, whole genome sequence assembly and efficient gene editing techniques using CRISPR/Cas9 have opened new possibilities for genetic studies. The quasi-immortal vegetatively-growing polyp colony stage provides a practical means to maintain mutant strains. In the context of developing Clytia as a genetic model, we report here an improved whole life cycle culture method including an aquarium tank system designed for culture of the tiny jellyfish form. We have compared different feeding regimes using Artemia larvae as food and demonstrate that the stage-dependent feeding control is the key for rapid and reliable medusa and polyp rearing. Metamorphosis of the planula larvae into a polyp colony can be induced efficiently using a new synthetic peptide. The optimized procedures detailed here make it practical to generate genetically modified Clytia strains and to maintain their whole life cycle in the laboratory

A Highly Conserved Poc1 Protein Characterized in Embryos of the Hydrozoan Clytia hemisphaerica: Localization and Functional Studies

Poc1 (Protein of Centriole 1) proteins are highly conserved WD40 domain-containing centriole components, well characterized in the alga Chlamydomonas, the ciliated protazoan Tetrahymena, the insect Drosophila and in vertebrate cells including Xenopus and zebrafish embryos. Functions and localizations related to the centriole and ciliary axoneme have been demonstrated for Poc1 in a range of species. The vertebrate Poc1 protein has also been reported to show an additional association with mitochondria, including enrichment in the specialized “germ plasm” region of Xenopus oocytes. We have identified and characterized a highly conserved Poc1 protein in the cnidarian Clytia hemisphaerica. Clytia Poc1 mRNA was found to be strongly expressed in eggs and early embryos, showing a punctate perinuclear localization in young oocytes. Fluorescence-tagged Poc1 proteins expressed in developing embryos showed strong localization to centrioles, including basal bodies. Anti-human Poc1 antibodies decorated mitochondria in Clytia, as reported in human cells, but failed to recognise endogenous or fluorescent-tagged Clytia Poc1. Injection of specific morpholino oligonucleotides into Clytia eggs prior to fertilization to repress Poc1 mRNA translation interfered with cell division from the blastula stage, likely corresponding to when neosynthesis normally takes over from maternally supplied protein. Cell cycle lengthening and arrest were observed, phenotypes consistent with an impaired centriolar biogenesis or function. The specificity of the defects could be demonstrated by injection of synthetic Poc1 mRNA, which restored normal development. We conclude that in Clytia embryos, Poc1 has an essentially centriolar localization and function

Two Oppositely Localised Frizzled RNAs as Axis Determinants in a Cnidarian Embryo

In phylogenetically diverse animals, including the basally diverging cnidarians, “determinants” localised within the egg are responsible for directing development of the embryonic body plan. Many such determinants are known to regulate the Wnt signalling pathway, leading to regionalised stabilisation of the transcriptional coregulator β-catenin; however, the only strong molecular candidate for a Wnt-activating determinant identified to date is the ligand Wnt11 in Xenopus. We have identified embryonic “oral–aboral” axis determinants in the cnidarian Clytia hemisphaerica in the form of RNAs encoding two Frizzled family Wnt receptors, localised at opposite poles of the egg. Morpholino-mediated inhibition of translation showed that CheFz1, localised at the animal pole, activates the canonical Wnt pathway, promotes oral fates including gastrulation, and may also mediate global polarity in the ectoderm. CheFz3, whose RNA is localised at the egg vegetal cortex, was found to oppose CheFz1 function and to define an aboral territory. Active downregulation mechanisms maintained the reciprocal localisation domains of the two RNAs during early development. Importantly, ectopic expression of either CheFz1 or CheFz3 was able to redirect axis development. These findings identify Frizzled RNAs as axis determinants in Clytia, and have implications for the evolution of embryonic patterning mechanisms, notably that diverse Wnt pathway regulators have been adopted to initiate asymmetric Wnt pathway activation

Apports du modèle Cnidaire (Clytia hemispaerica sur l'origine de la polarité primaire de l'ovocyte et sur l'étude du rôle de la kinase Mos dans la régulation de la maturation méiotique)

L objectif de cette thèse vise à améliorer la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l origine de la polarité primaire, animale-végétative (a-v) de l oeuf, ainsi que l étude des molécules et mécanismes de régulation des transitions méiotiques. Pour cela, le modèle d étude choisi a été la méduse, Clytia hemisphaerica. Ce projet profite des avantages expérimentaux uniques de ce nouveau modèle cnidaire, extrêmement bien adapté pour l étude descriptive et fonctionnelle des différentes étapes de l ovogenèse. La démonstration récente de la présence de déterminants maternels du développement localisés dans l œuf selon la polarité a-v chez Clytia hemisphaerica, implique que comme chez d autres organismes, la polarité embryonnaire chez ce cnidaire trouve ses origines au cours de l ovogenèse. L étude de l organisation intracellulaire des différents stades ovocytaires au cours de l ovogenèse et de la maturation méiotique, avec une attention particulière aux ARNs déterminants, CheFz1, CheFz3 et CheWnt3, a permis de montrer que la polarité a-v de l œuf chez Clytia s effectue en fin de période de croissance de l ovocyte et se renforce au cours de la maturation ovocytaire. Trois voies de localisation des ARNs bien distinctes ont été mises en évidence. Même si la polarité de l ovocyte préfigure la polarité orale-aborale (O-A) de l embryon, le déplacement du noyau après fécondation est capable de réorienter cet axe. Pour réconcilier la flexibilité de l axe avec la présence d ARNs déterminants de polarité localisés dans l ovocyte, j ai examiné la localisation des ARNs après manipulations expérimentales. Uniquement l ARNm de CheFz1 se déplace avec le noyau dans les œufs centrifugés. Cet ARN est ainsi un bon candidat pour expliquer la réorientation de l axe. Comme dans les ovocytes de modèles expérimentaux bilatériens (xénope, souris, étoile de mer), la régulation des transitions méiotiques chez Clytia fait intervenir la protéine kinase Mos. Mos participe dans le déclenchement de la maturation méiotique chez le xénope, tandis qu elle est nécessaire pour l arrêt du cycle cellulaire dans les œufs non fécondés chez diverses espèces. Nous avons identifié chez Clytia deux gènes Mos exprimés spécifiquement dans les ovocytes et démontré que les deux kinases CheMos1 et CheMos2 possèdent une activité cytostatique classique, qui passe par l activation de la MAP kinase. CheMos1 et CheMos2 agissent ensemble au cours de la maturation méiotique afin de promouvoir des événements important pour la complétion des deux méioses et l arrêt cytostatique en G1 post-méiotique. L expression de CheMos2 avant la maturation ovocytaire pourrait également avoir un rôle dans des événements en aval de la maturation. Les résultats des analyses de Mos chez Clytia suggèrent une conservation du rôle de Mos/MAPK dans la maturation ovocytaire chez les vertébrés et les cnidaires et soulèvent les hypothèses sur le rôle ancestral chez les eumétazoaires.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Etude du mécanisme et de la régulation de la rotation corticale dans l'oeuf de xénope

La rotation corticale dans l'œuf de xénope établit le centre organisateur de l'embryon. La translocation du cortex par rapport au cytoplasme commence lorsqu'un réseau sous cortical végétatif de microtubules dont l'extrémité + est dirigée dans la direction de la translocation se met en place. Le cortex est déplacé par l'action de moteurs moléculaires dépendants des microtubules, les protéines de la famille de la kinésine (Kinesin Related Proteins) et de la dynéine cytoplasmique. La participation des KRP au mécanisme de la rotation corticale a été démontrée par l'injection dans l'œuf d'un anticorps inhibiteur des KRP qui a provoqué l'inhibition de la rotation corticale, la désorganisation du réseau sous cortical de microtubules et une perturbation du comportement des microtubules du réseau. La participation de la dynéine a d'abord été suggérée par l'observation que l'inhibition des KRP in vivo n'arrêtait pas le mouvement des microtubules. L'inhibition du mouvement des microtubules, réactivé sur cortex isolés par la perfusion d'ATP et extraits interphasiques d'œuf de xénope, provoquée par l'ajout d'anticorps anti-dynéine conbiné avec l'anti-KRP a conforté cette hypothèse. L'injection précoce de la dynamitine, un inhibiteur des transports dynéine dépendants, a perturbé l'organisation du réseau de microtubules tandis que l'injection tardive de dynamitine ne pertubait pas la translocation du cortex. Ces résultats indiquent que la dynéine transporte les microtubules jusqu'au cortex puis maintient le réseau de microtubules au début de la rotation corticale. Ensuite la dynéine n'est plus nécessaire indiquant que les KRP transportent le cortex sur les microtubules du réseau.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocVILLEFRANCHE/MER-Observ.Océano (061592201) / SudocSudocFranceF

Identification et caractérisation d'ARNs localisés et de protéines maternels chez Clytia hemisphaerica

Chez les métazoaires, les premières phases du développement embryonnaire sont assurées par des facteurs maternels de nature variée. Accumulées et positionnées dans l œuf au cours de sa formation, ces molécules constituent les ressources en nutriments nécessaires et les informations permettant de gouverner la mise en place du plan d organisation de l embryon. Cette thèse illustre le rôle fondamental de facteurs maternels dans le développement embryonnaire chez le cnidaire Clytia hemisphaerica à travers trois volets. Le premier aborde le phénomène de localisation des ARNs. A la suite de la découverte des ARNs déterminants CheFz1, CheFz3 et CheWnt3, de nouveaux ARNs maternels, localisés dans l œuf de Clytia selon différents patrons, ont été identifiés. L étude des mécanismes de localisation de ces ARNs a été débutée par une première analyse des séquences 3 UTRs et l observation du comportement d ARNs fluorescents injectés dans les ovocytes en cours de maturation. Le deuxième volet concerne la protéine centriolaire Poc1, qui chez Clytia hemisphaerica a une localisation centrosomale et est nécessaire pour assurer les divisions cellulaires et la gastrulation. Le troisième volet concerne les protéines fluorescentes GFP et les photoprotéines Clytines. Chez Clytia, un gène GFP ainsi qu un gène Clytine sont spécifiquement exprimés dans les ovocytes et leurs protéines co-adressées aux mitochondries. Un transfert d énergie in vivo a été mis en évidence dans les œufs, indiquant un couplage fonctionnel des deux protéines maternelles. Dans l ensemble, ce travail a fourni de nouvelles connaissances concernant la phase maternelle du développement chez une espèce modèle émergentePARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF