Caracterización funcional de la vía del microRNA390/TAS3 en el desarrollo de órganos laterales en las raíces de la leguminosa Medicago truncatula

Las plantas adaptan su arquitectura de raíz como parte de la respuesta a los cambios en las condiciones ambientales, tales como disponibilidad de agua, nutrientes y estreses de tipo biótico y abiótico. En particular, las plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces, las raíces laterales (RLs) y los nódulos fijadores de nitrógeno. Las RLs participan en el anclaje de la planta al suelo y en la incorporación de agua y nutrientes. Los nódulos, los cuales se desarrollan a partir de la interacción simbiótica entre las leguminosas y las bacterias del suelo conocidas como rizobios, proveen compuestos nitrogenados asimilables a la planta. Ambos órganos poseen un fuerte impacto en el crecimiento de la planta, por lo tanto la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de las RLs y los nódulos contribuiría a mejorar y aumentar el rendimiento de cultivos de importancia agronómica, así como también a recuperar tierras pobres en nitrógeno y reducir el impacto negativo de los fertilizantes químicos sobre la biodiversidad. Los microRNAs (miRNAs) son pequeños RNAs de 21-22 nucleótidos que actúan como reguladores post-transcripcionales de la expresión génica en organismos eucariotas durante el desarrollo de nuevos órganos o en respuesta a estímulos ambientales. En los últimos años, se han descripto miRNAs cuyos niveles se acumulan diferencialmente en diferentes etapas del desarrollo de las RLs o nódulos, sin embargo sólo un número reducido de ellos han sido caracterizados en detalle y asociados con una función en la infección rizobiana y/o la organogénesis y desarrollo del nódulo. En el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como objetivo general caracterizar la vía de miR390/TAS3 durante el desarrollo de los órganos laterales en las raíces de la leguminosa modelo M. truncatula. El miR390 se asocia a la proteína ARGONAUTA7 y posee como target al transcripto no codificante TAS3, a partir del cual se generan los trans-acting interference small RNA (tasiRNAs). Estos tasiRNAs regulan mediante un mecanismo de clivaje los niveles de los transcriptos que codifican los Factores de Transcripción Regulados por Auxinas (ARF)2, ARF3 y ARF4, por lo que han sido denominados tasiARFs. Estudios previos en nuestro laboratorio, sugirieron que la vía miR390/TAS3 estaría involucrada en la infección rizobiana y/o en la organogénesis del nódulo. Con el fin de evaluar la acumulación y la expresión espacio-temporal de los transcriptos y los pequeños RNAs que componen esta vía en diferentes estadios de desarrollo de los órganos laterales de la raíz, se llevaron a cabo reacciones de RT-qPCR y fusiones transcripcionales de los promotores a los genes reporteros gfp y uidA (también conocido como gen gus dado que codifica la proteína β-glucuronidasa (GUS)). Estos resultados mostraron que la vía miR390/TAS3 se reprime en etapas tempranas de la interacción entre M. truncatula y S. meliloti, liberando la represión post-transcripcional de ARF2, ARF3 y ARF4. A su vez, hemos identificado y validado una nueva variante del transcripto TAS3 que probablemente actúa como un target mimicry endógeno de miR390 y contribuiría a disminuir los niveles de miR390 en esta etapa. En estadios más avanzados de la interacción, la vía es re-activada quedando restringida a la zona apical del nódulo. Para indagar sobre la función de la vía se generaron raíces transgénicas que sobreexpresaban el precursor de miR390b (OX390) o un target mimicry de miR390 (MIM390) capaz de secuestrar al miR390 y bloquear su acción. Además de la estrategia de expresión target mimicry, se utilizaron líneas mutantes en el gen AGO7, en las cuales la vía miR390/TAS3 se encuentra inactiva. La evaluación del fenotipo asociado a la arquitectura de raíz y a la nodulación en las plantas OX390, MIM390 y ago7 reveló que la vía miR390/TAS3 actúa como un regulador positivo sobre la elongación de las RLs, posiblemente como consecuencia del incremento de la señalización y/o respuesta a auxinas, y como un módulo represor de la infección rizobiana y el desarrollo de nódulos. A su vez, la inactivación de la vía miR390/TAS3, ya sea en las raíces MIM390 o ago7, resultó en el desarrollo de nódulos que presentan una distribución espacial y morfología alterada. El análisis de la acumulación de transcriptos, previamente descriptos como marcadores de la nodulación, en las raíces OX390, MIM390 y ago7 permitió establecer una correlación entre los niveles de ARF2, ARF3 y ARF4 y dos factores de transcripción de la familia GRAS designados NSP (Nodulation Signaling Pathway)1 y NSP2, sugiriendo que ambos factores de transcripción serían los candidatos por medio de los cuales la vía de miR390/TAS3 y la vía de señalización de la nodulación se intersectan. Con el objetivo de identificar genes cuyos niveles de acumulación se encuentran afectados directa o indirectamente por la sobreexpresión de miR390, se caracterizó el transcriptoma de las raíces OX390 en presencia y ausencia del rizobio mediante RNA-seq. El análisis in silico de los datos generados permitió identificar genes con expresión diferencial regulados negativamente o positivamente en respuesta a la sobreexpresión de miR390. Entre estos, se destacan genes marcadores de nodulación, factores de transcripción miembros de la familia LOB, genes involucrados en la respuesta y señalización de hormonas y genes relacionados con la traducción. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis doctoral han permitido avanzar en el conocimiento sobre la regulación post-transcripcional de genes durante dos procesos de desarrollo con relevancia ecológica y agronómica. Este conocimiento podría ser aplicado en etapas futuras a la optimización de incorporación de nutrientes y nitrógeno en las plantas, contribuyendo a mejorar y aumentar el rendimiento de los cultivos de leguminosas.Facultad de Ciencias Exacta

The MicroRNA390/TAS3 Pathway Mediates Symbiotic Nodulation and Lateral Root Growth

Legume roots form two types of postembryonic organs, lateral roots and symbiotic nodules. Nodule formation is the result of the interaction of legumes with rhizobia and requires the mitotic activation and differentiation of root cells as well as an independent, but coordinated, program that allows infection by rhizobia. MicroRNA390 (miR390) is an evolutionarily conserved microRNA that targets the Trans-Acting Short Interference RNA3 (TAS3) transcript. Cleavage of TAS3 by ARGONAUTE7 results in the production of trans-acting small interference RNAs, which target mRNAs encoding AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2), ARF3, and ARF4. Here, we show that activation of the miR390/TAS3 regulatory module by overexpression of miR390 in Medicago truncatula promotes lateral root growth but prevents nodule organogenesis, rhizobial infection, and the induction of two key nodulation genes, Nodulation Signaling Pathway1 (NSP1) and NSP2. Accordingly, inactivation of the miR390/TAS3 module, either by expression of a miR390 target mimicry construct or mutations in ARGONAUTE7, enhances nodulation and rhizobial infection, alters the spatial distribution of the nodules, and increases the percentage of nodules with multiple meristems. Our results revealed a key role of the miR390/TAS3 pathway in legumes as a modulator of lateral root organs, playing opposite roles in lateral root and nodule development.Facultad de Ciencias Exacta

Reprogramming of root cells during nitrogen-fixing symbiosis involves dynamic polysome association of coding and noncoding RNAs

Translational control is a widespread mechanism that allows the cell to rapidly modulate gene expression in order to provide flexibility and adaptability to eukaryotic organisms. We applied translating ribosome affinity purification combined with RNA sequencing to characterize translational regulation of mRNAs at early stages of the nitrogen-fixing symbiosis established between Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti. Our analysis revealed a poor correlation between transcriptional and translational changes and identified hundreds of regulated protein-coding and long noncoding RNAs (lncRNAs), some of which are regulated in specific cell types. We demonstrated that a short variant of the lncRNA Trans-acting small interference RNA3 (TAS3) increased its association to the translational machinery in response to rhizobia. Functional analysis revealed that this short variant of TAS3 might act as a target mimic that captures microRNA390, contributing to reduce trans acting small interference Auxin Response Factor production and modulating nodule formation and rhizobial infection. The analysis of alternative transcript variants identified a translationally upregulated mRNA encoding subunit 3 of the SUPERKILLER complex (SKI3), which participates in mRNA decay. Knockdown of SKI3 decreased nodule initiation and development, as well as the survival of bacteria within nodules. Our results highlight the importance of translational control and mRNA decay pathways for the successful establishment of the nitrogen-fixing symbiosis.Fil: Traubenik, Laura Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Reynoso, Mauricio Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Hobecker, Karen Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Lancia, Marcos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Hummel, Maureen. University of California; Estados UnidosFil: Rosen, Benjamin. J. Craig Venter Institute; Estados UnidosFil: Town, Christopher. J. Craig Venter Institute; Estados UnidosFil: Bailey Serres, Julia. University of California; Estados UnidosFil: Blanco, Flavio Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Zanetti, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; Argentin

The MicroRNA390/TAS3 Pathway Mediates Symbiotic Nodulation and Lateral Root Growth

Legume roots form two types of postembryonic organs, lateral roots and symbiotic nodules. Nodule formation is the result of the interaction of legumes with rhizobia and requires the mitotic activation and differentiation of root cells as well as an independent, but coordinated, program that allows infection by rhizobia. MicroRNA390 (miR390) is an evolutionarily conserved microRNA that targets the Trans-Acting Short Interference RNA3 (TAS3) transcript. Cleavage of TAS3 by ARGONAUTE7 results in the production of trans-acting small interference RNAs, which target mRNAs encoding AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2), ARF3, and ARF4. Here, we show that activation of the miR390/TAS3 regulatory module by overexpression of miR390 in Medicago truncatula promotes lateral root growth but prevents nodule organogenesis, rhizobial infection, and the induction of two key nodulation genes, Nodulation Signaling Pathway1 (NSP1) and NSP2. Accordingly, inactivation of the miR390/TAS3 module, either by expression of a miR390 target mimicry construct or mutations in ARGONAUTE7, enhances nodulation and rhizobial infection, alters the spatial distribution of the nodules, and increases the percentage of nodules with multiple meristems. Our results revealed a key role of the miR390/TAS3 pathway in legumes as a modulator of lateral root organs, playing opposite roles in lateral root and nodule development.Facultad de Ciencias Exacta

Post-transcriptional reprogramming during root nodule symbiosis

Plant cells adjust their genetic programs integrating developmentaland environmental cues, leading to a constantreprogramming in gene expression that contributes to thephysiological and ecological adaptation of the whole plant.Legume plants establish a nitrogen fixing symbiosis with soilbacteria known as rhizobia, providing an exquisite biologicalmodel to study reprogramming of gene expression in a pluricellulareukaryotic organism interacting with its prokaryoticmicrosymbiont in a changing environmental context, whichalso impacts on the output of the symbiotic association. Manystudies in this field have focused on the modification of theplant transcriptome during the onset of the interaction, takingadvantage of the DNA microarray and direct RNA sequencing(RNA-seq) technologies. As a consequence, most of theinformation available describes changes in the steady-statelevels of poly A+ RNAs at different stages of the interaction (ElYahyaoui et al. 2004; Lohar et al. 2006; Benedito et al. 2008;Breakspear et al. 2014; Roux et al. 2014), underestimating thepost-transcriptional mechanisms that add new layers of regulationto the reprogramming of gene expression. In the last years,a number of studies have contributed to a more comprehensiveunderstanding of these changes, highlighting the importance ofthe stability and translatability of poly A+ RNAs, as well as therole of endogenous small RNAs (sRNAs), mainly microRNAs(miRNAs) and phased small interfering RNAs (phasiRNAs),as key regulators of gene expression. In this chapter, we willsummarize the contribution of translational regulation to thegenetic responses of the plant during root nodule symbiosisand the crucial roles played by sRNAs in this ecologically andagronomically important interaction.Fil: Reynoso, Mauricio Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Traubenik, Laura Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Hobecker, Karen Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Blanco, Flavio Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Zanetti, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Biotecnología y Biología Molecular; Argentin

Auxin Response Factor 2 (ARF2), ARF3, and ARF4 Mediate Both Lateral Root and Nitrogen Fixing Nodule Development in <i>Medicago truncatula</i>

Auxin Response Factors (ARFs) constitute a large family of transcription factors that mediate auxin-regulated developmental programs in plants. ARF2, ARF3, and ARF4 are post-transcriptionally regulated by the microRNA390 (miR390)/trans-acting small interference RNA 3 (TAS3) module through the action of TAS3-derived trans - acting small interfering RNAs (ta-siRNA). We have previously reported that constitutive activation of the miR390/TAS3 pathway promotes elongation of lateral roots but impairs nodule organogenesis and infection by rhizobia during the nitrogen-fixing symbiosis established between Medicago truncatula and its partner Sinorhizobium meliloti. However, the involvement of the targets of the miR390/TAS3 pathway, i.e., MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, in root development and establishment of the nitrogen-fixing symbiosis remained unexplored. Here, promoter:reporter fusions showed that expression of both MtARF3 and MtARF4a was associated with lateral root development; however, only the MtARF4a promoter was active in developing nodules. In addition, up-regulation of MtARF2, MtARF3, and MtARF4a/b in response to rhizobia depends on Nod Factor perception. We provide evidence that simultaneous knockdown of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b or mutation in MtARF4a impaired nodule formation, and reduced initiation and progression of infection events. Silencing of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b altered mRNA levels of the early nodulation gene nodulation signaling pathway 2 (MtNSP2). In addition, roots with reduced levels of MtARF2, MtARF3, MtARF4a, and MtARF4b, as well as arf4a mutant plants exhibited altered root architecture, causing a reduction in primary and lateral root length, but increasing lateral root density. Taken together, our results suggest that these ARF members are common key players of the morphogenetic programs that control root development and the formation of nitrogen-fixing nodules.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula

The microRNA390/TAS3 pathway mediates symbiotic nodulation and lateral root growth

International audienceLegume roots form two types of postembryonic organs, lateral roots and symbiotic nodules. Nodule formation is the result of the interaction of legumes with rhizobia and requires the mitotic activation and differentiation of root cells as well as an independent, but coordinated, program that allows infection by rhizobia. MicroRNA390 (miR390) is an evolutionarily conserved microRNA that targets the Trans-Acting Short Interference RNA3 (TAS3) transcript. Cleavage of TAS3 by ARGONAUTE7 results in the production of trans-acting small interference RNAs, which target mRNAs encoding AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2), ARF3, and ARF4. Here, we show that activation of the miR390/TAS3 regulatory module by overexpression of miR390 in Medicago truncatula promotes lateral root growth but prevents nodule organogenesis, rhizobial infection, and the induction of two key nodulation genes, Nodulation Signaling Pathway1 (NSP1) and NSP2. Accordingly, inactivation of the miR390/TAS3 module, either by expression of a miR390 target mimicry construct or mutations in ARGONAUTE7, enhances nodulation and rhizobial infection, alters the spatial distribution of the nodules, and increases the percentage of nodules with multiple meristems. Our results revealed a key role of the miR390/TAS3 pathway in legumes as a modulator of lateral root organs, playing opposite roles in lateral root and nodule development

Reprogramming of Root Cells during Nitrogen-Fixing Symbiosis Involves Dynamic Polysome Association of Coding and Noncoding RNAs

Translational control is a widespread mechanism that allows the cell to rapidly modulate gene expression in order to provide flexibility and adaptability to eukaryotic organisms. We applied translating ribosome affinity purification combined with RNA sequencing to characterize translational regulation of mRNAs at early stages of the nitrogen-fixing symbiosis established between Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti. Our analysis revealed a poor correlation between transcriptional and translational changes and identified hundreds of regulated protein-coding and long noncoding RNAs (lncRNAs), some of which are regulated in specific cell types. We demonstrated that a short variant of the lncRNA Trans-acting small interference RNA3 (TAS3) increased its association to the translational machinery in response to rhizobia. Functional analysis revealed that this short variant of TAS3 might act as a target mimic that captures microRNA390, contributing to reduce trans acting small interference Auxin Response Factor production and modulating nodule formation and rhizobial infection. The analysis of alternative transcript variants identified a translationally upregulated mRNA encoding subunit 3 of the SUPERKILLER complex (SKI3), which participates in mRNA decay. Knockdown of SKI3 decreased nodule initiation and development, as well as the survival of bacteria within nodules. Our results highlight the importance of translational control and mRNA decay pathways for the successful establishment of the nitrogen-fixing symbiosis.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Biotecnologia y Biologia Molecula